총 20개
-
SDS-PAGE2025.01.121. SDS-PAGE SDS-PAGE는 단백질을 분리하는 기술로, 전기영동 이동성을 이용한다. 단백질은 SDS 처리를 통해 균일하게 음전하를 띠게 되어 분자량에 따라 분리될 수 있다. 이 실험에서는 단백질 발현에 IPTG의 영향을 확인하고자 하였으나 이전 실험 결과의 불확실성으로 인해 IPTG의 영향을 명확히 알기 어려웠다. 단백질 염색 결과를 통해 약 45 kDa 크기의 단백질이 분리된 것을 확인할 수 있었다. 2. Discontinuous Buffer System Discontinuous buffer system은 stackin...2025.01.12
-
대장균에서 재조합 단백질의 생산과 Western blot에 관한 실험2025.01.131. IPTG IPTG는 대장균 lactose operon의 효소합성을 유도하는 강력한 유도물질이다. 보통 유도물질은 operon의 활동에 의해 만들어지는 β-D-galactosidase에 의해 대사 이용하는 것이 많지만, IPTG는 분해되지 않아 비대사성 유도물질이라고도 불린다. 또한, 고농도로 사용시 galactoside permease가 없는 세포에도 투과할 수 있기 때문에 permease가 없는 균주에서의 유도실험에도 사용된다. 2. Buffer condition Tank buffer에는 glycine과 Cl-(Tris-ba...2025.01.13
-
재결합 단백질의 발현/ Expression of recombinant proteins in E. coli2025.01.121. GST-tagged Proteins glutathione S-transferase (GST), histidine (HIS), 기타 친화성 태그를 이용하여 단백질을 정제하게 되면 기존에 잘 알려진 생화학적 특성을 가진 단백질과 알려지지 않은 생화학적 특성을 가진 재조합 단백질의 N 말단에 결합하여 정제를 도와준다. GST 단백질은 번역 시에 안정적이고 가용성이 높은 단백질로 빠르게 접히기 때문에, GST 태그를 포함하면 태그가 없을 때보다 더 잘 발현하고 용해도를 촉진하는 경우가 많다. 2. BCA assay BCA는 Lowry...2025.01.12
-
A+ 생화학실험 <12주차. Protein expression> 레포트2025.01.201. 발현 벡터 (pET vector) 발현 벡터(expression vector)는 분자 클로닝 결과로 얻은 재조합 DNA를 competent cell을 비롯한 다른 세포에 전달하는 데 사용한다. pET 벡터는 E. coli에서 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용하는 대표적인 발현 벡터이다. pET 벡터는 플라스미드에 해당하나, 이 외에도 viral vector나 artificial chromosome 등이 발현 벡터로 사용될 수 있다. 발현 벡터의 역할을 하기 위해서는 세포 내에서 자가 복제가 가능해야 하며, 제한 효소에 의한 ...2025.01.20
-
Taq DNA Polymerase 발현 및 정제, PCR을 통한 확인2025.12.141. Taq DNA Polymerase 발현 및 정제 pTTQ18 vector를 사용하여 E.coli에서 Taq DNA polymerase를 lac operon으로 발현시켰다. Cell disruption 방법으로 enzymatic method와 detergent method를 사용하였고, Taq DNA polymerase는 Thermus aquaticus에서 유래하여 고온에서 안정하므로 75°C에서 1시간 incubation하여 다른 단백질과 분리하였다. Salting out으로 ammonium sulfate를 사용하여 단백질을 ...2025.12.14
-
Taq DNA polymerase 발현, 정제 및 PCR 확인2025.12.191. Taq DNA polymerase 발현 및 정제 pTTQ18 vector의 lac operon system을 이용하여 E. coli에서 Taq DNA polymerase를 과발현시킨다. IPTG를 inducer로 사용하여 지속적인 발현을 유도하고, cell disruption(Enzymatic method, Detergent method)으로 세포를 파괴한다. Heat inactivation으로 다른 단백질을 제거하고, ammonium sulfate를 이용한 salting out과 protein dialysis를 통해 목표 단...2025.12.19
-
TA 클로닝과 형질전환을 이용한 재조합 플라스미드 제작2025.12.121. TA 클로닝 TA 클로닝은 PCR 산물의 3' 말단에 부가된 deoxyadenosine(dA)과 T-vector의 3' 말단의 deoxythymidine(dT)이 상보적으로 수소결합하는 원리를 이용한 클로닝 방법이다. Topoisomerase가 CCTT 염기서열을 인지하여 nick이나 결손 부위를 연결하고, PCR 산물과 vector가 만나면 topoisomerase가 양쪽의 PO3와 OH기를 연결하여 covalent bond energy를 통해 짧은 시간에 ligation이 진행된다. 추가적인 ligase 없이도 효율적으로 ...2025.12.12
-
단백질 정제2025.01.231. 재조합 단백질 발현 재조합 단백질 기법은 정제하려고 하는 단백질의 유전자를 플라스미드 벡터에 삽입한 후, 이 플라스미드 벡터를 다시 세포에 도입하면 그 세포가 도입된 외부 유전자를 마치 원래 자기가 가지고 있던 유전자인 것처럼 발현을 하는 방법이다. 이번 단백질 정제실험에서 사용하는 플라스미드인 pET28a Vector는 kanamycin이라는 항생제에 대한 저항성을 부여하는 유전자인 KanR을 갖고 있어, 배양액에 kanamycin 항생제를 넣어놓고 그곳에 대장균을 넣으면 KanR을 갖고 있는 플라스미드인 pET28a Vec...2025.01.23
-
Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용한 His-tagged 단백질 정제2025.11.161. Ni-NTA Agarose를 이용한 단백질 정제 6x-His tagged protein을 Ni-NTA agarose 수지를 이용하여 chromatography를 통해 정제한다. Histidine의 imidazole ring의 N 2개가 NTA에 결합된 Ni 원자에 결합하여 단백질이 정제된다. Washing buffer와 elution buffer에 포함된 imidazole은 competitive agent로 작용하여 contaminant protein과 bead의 결합을 줄이고 최종 순도를 높인다. 실험 결과 약 70kDa의 ...2025.11.16
-
His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제2025.12.171. eGFP 단백질 발현 및 정제 His tagged eGFP 단백질을 E.coli BL21(DE3) 시스템에서 과발현시키고 affinity chromatography를 통해 정제하는 과정. pET28a(+) vector에 eGFP 유전자를 클로닝하고 IPTG로 유도하여 6x His tagged eGFP를 과발현. Sonication으로 세포를 파괴하고 His tag와 니켈 이온의 친화성을 이용한 정제. Ultrafiltration으로 농축하여 최종 정제 단백질 획득. 2. 단백질 정량 방법 비교 Extinction coeffic...2025.12.17
1 / 2
