A+ 생화학실험 <12주차. Protein expression> 레포트

문서 내 토픽

• 1. 발현 벡터 (pET vector)

  발현 벡터(expression vector)는 분자 클로닝 결과로 얻은 재조합 DNA를 competent cell을 비롯한 다른 세포에 전달하는 데 사용한다. pET 벡터는 E. coli에서 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용하는 대표적인 발현 벡터이다. pET 벡터는 플라스미드에 해당하나, 이 외에도 viral vector나 artificial chromosome 등이 발현 벡터로 사용될 수 있다. 발현 벡터의 역할을 하기 위해서는 세포 내에서 자가 복제가 가능해야 하며, 제한 효소에 의한 digestion이 필요하므로 제한 효소에 의해 인식될 수 있는 서열이 포함되어 있어야 한다. 선택적 마커로 사용될 수 있는 유전자도 포함하는 것이 바람직하다.

• 2. 오페론 (lac 오페론)

  오페론(Operon)은 기능적으로 연관된 단백질의 발현을 조절하는 밀집된 유전자 발현 시스템이다. 오페론은 단백질 구조에 대한 정보를 담고 있는 구조 유전자인 structural gene, 이 구조 유전자의 작동을 제어하는 operator, operator와 structural gene 사이에 위치한 promoter, 그리고 operator 근처에 위치한 조절 유전자인 regulatory gene 으로 구성된다. lac 오페론은 포도당을 주 에너지원으로 사용하는 생물에서 발견되는 시스템으로, promoter, operator, 그리고 LacZ, LacY, LacA 유전자로 구성된다.

• 3. 유도제 (IPTG)

  유도제(Inducer)는 유전자나 오페론의 발현을 유도하는 물질로, 두 가지 주요 메커니즘을 통해 작동한다. 첫 번째 메커니즘은 inducer가 repressor에 결합하여 억제 작용을 비활성화하는 것이고, 두 번째 메커니즘은 activator에 결합하여 타겟 유전자를 활성화하는 것이다. 본 실험에서 사용할 inducer는 IPTG (isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)이다. IPTG는 lac 오페론에서 repressor를 비활성화 하는 데 사용될 수 있다.

• 4. 흡광도 (OD600)

  Optical Density(OD)는 용액에서 빛이 얼마나 흡수되는지를 나타내는 값으로, -log T에 해당한다. 여기서 T는 투과율(transmittance)로, 투과된 빛의 강도(P)를 입사된 빛의 강도(P0)로 나눈 값이다. OD는 일반적으로 용액의 농도를 정량화 하는 데 사용되지만, 생화학 실험에서는 세포 성장 상태를 확인하는 데 자주 활용된다. 세포가 빛을 얼마나 흡수하는지를 측정하여 세포의 양을 파악한다.

• 5. 세균 성장 곡선

  세균의 성장 곡선은 적응기, 로그 성장기, 정체기, 사멸기의 네 단계로 구성되어 있다. 각 단계는 세포가 환경에 적응하고, 자원을 활용하여 증식하며, 환경 저항에 의해 성장이 제한되고, 결국 자원 고갈로 인해 사멸하는 과정을 나타낸다. 이러한 성장 곡선을 이해하는 것은 세포 배양 실험과 생화학 연구에서 매우 중요하다.

• 6. 녹색 형광 단백질 (GFP)

  GFP는 가시광선의 blue 영역부터 ultra violet 영역의 빛을 흡수하여 가시광선 초록색 영역의 빛을 방출하는 단백질이다. GFP는 외부의 다른 물질(효소, 기질, 보조 인자 등)이 필요 없이 독립적으로 안정적인 형광을 방출하기 때문에, 다양한 생물학 및 유전학 실험에 널리 활용된다. 본 실험에서 발현할 단백질은 emGFP(emerald Green Fluorescent Protein)로, 일반 GFP보다 더 밝고 안정적인 형광을 방출한다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. 발현 벡터 (pET vector)

  발현 벡터 pET는 대장균에서 단백질 발현을 위해 널리 사용되는 플라스미드 벡터입니다. pET 벡터는 T7 프로모터와 lac 오페론 조절 시스템을 이용하여 강력한 단백질 발현을 가능하게 합니다. 이 벡터는 다양한 클로닝 부위, 항생제 내성 마커, 그리고 단백질 정제를 위한 태그 서열 등을 포함하고 있어 유용한 도구로 활용되고 있습니다. 발현 조건 최적화, 숙주 세포주 선택, 그리고 정제 과정 등 pET 벡터를 이용한 단백질 생산에는 많은 기술적 고려사항이 있지만, 이를 통해 다양한 재조합 단백질을 효율적으로 생산할 수 있습니다.

• 2. 오페론 (lac 오페론)

  lac 오페론은 대장균에서 유당 대사와 관련된 유전자들의 발현을 조절하는 대표적인 오페론 시스템입니다. lac 오페론은 구조 유전자(lacZ, lacY, lacA), 조절 유전자(lacI), 그리고 프로모터와 오페레이터 영역으로 구성되어 있습니다. 유당이 없을 때는 억제 단백질 LacI가 오페레이터 부위에 결합하여 오페론의 전사를 억제하지만, 유당이 존재하면 LacI가 유당과 결합하여 오페레이터에서 떨어져 나와 전사가 활성화됩니다. 이러한 유도 가능한 발현 조절 메커니즘은 재조합 단백질 생산, 유전자 발현 연구, 그리고 합성 생물학 등 다양한 분야에서 널리 활용되고 있습니다.

• 3. 유도제 (IPTG)

  IPTG(Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside)는 lac 오페론 시스템에서 유도제로 사용되는 합성 유사체입니다. IPTG는 LacI 억제 단백질과 결합하여 오페레이터 부위에서 LacI를 떼어내, lac 오페론의 전사를 활성화시킵니다. 이를 통해 lac 프로모터 아래에 있는 재조합 유전자의 발현을 유도할 수 있습니다. IPTG는 천연 유당과 달리 세포 내에서 대사되지 않아 지속적인 유도 효과를 나타내며, 농도 의존적으로 발현을 조절할 수 있다는 장점이 있습니다. 따라서 IPTG는 대장균을 이용한 재조합 단백질 생산 시스템에서 필수적인 시약으로 활용되고 있습니다.

• 4. 흡광도 (OD600)

  OD600(Optical Density at 600nm)은 세균 배양액의 탁도를 측정하여 세포 밀도를 간접적으로 확인하는 지표입니다. 600nm 파장의 빛을 세균 배양액에 통과시켜 흡수되는 정도를 측정하면, 이 값은 세포 수와 비례하게 증가합니다. OD600 측정은 세균 배양 과정에서 세포 성장 곡선을 모니터링하거나, 특정 시점의 세포 밀도를 확인하는 데 유용합니다. 또한 OD600 값을 기준으로 동일한 세포 밀도를 가지는 샘플을 준비할 수 있어, 실험 결과의 재현성을 높일 수 있습니다. 따라서 OD600 측정은 세균 배양 및 실험에서 필수적인 기술이라고 할 수 있습니다.

• 5. 세균 성장 곡선

  세균 성장 곡선은 시간에 따른 세균 배양액의 세포 밀도 변화를 나타낸 그래프입니다. 일반적으로 세균 성장 곡선은 지연기, 대수기, 정지기, 사멸기의 4단계로 구분됩니다. 지연기에는 세포가 새로운 환경에 적응하는 과정이, 대수기에는 세포가 최대 속도로 증식하는 과정이 나타납니다. 정지기에는 영양분 고갈 등으로 증식이 멈추고, 사멸기에는 세포 사멸이 일어납니다. 세균 성장 곡선 분석을 통해 배양 조건, 유전자 발현, 대사 활성 등 다양한 정보를 얻을 수 있습니다. 이는 재조합 단백질 생산, 미생물 생태학 연구, 항생제 내성 분석 등 세균 관련 연구에 필수적인 기술입니다.

• 6. 녹색 형광 단백질 (GFP)

  녹색 형광 단백질(GFP)은 해파리에서 유래한 단백질로, 청색광을 흡수하여 녹색 형광을 발산하는 특성을 가지고 있습니다. GFP는 유전자 발현 분석, 단백질 localization 연구, 세포 이미징 등 다양한 분야에서 널리 활용되는 유용한 분자 표지자입니다. GFP는 세포 독성이 낮고, 자가 형광을 발현하므로 별도의 기질이나 보조인자 없이도 관찰이 가능합니다. 또한 유전자 융합을 통해 다양한 단백질과 결합시킬 수 있어, 단백질의 발현, 분포, 상호작용 등을 실시간으로 모니터링할 수 있습니다. 이처럼 GFP는 생물학 연구에서 필수적인 도구로 자리잡고 있으며, 앞으로도 다양한 응용 분야에서 활용될 것으로 기대됩니다.