Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용한 His-tagged 단백질 정제

본 내용은 " 7주차_단백질정제 " 의 원문 자료에서 일부 인용된 것입니다. 2023.11.15

문서 내 토픽

• 1. Ni-NTA Agarose를 이용한 단백질 정제

  6x-His tagged protein을 Ni-NTA agarose 수지를 이용하여 chromatography를 통해 정제한다. Histidine의 imidazole ring의 N 2개가 NTA에 결합된 Ni 원자에 결합하여 단백질이 정제된다. Washing buffer와 elution buffer에 포함된 imidazole은 competitive agent로 작용하여 contaminant protein과 bead의 결합을 줄이고 최종 순도를 높인다. 실험 결과 약 70kDa의 단백질이 정제되었으며, 예측값 75kDa과 유사한 크기를 보였다.

• 2. 단백질 발현 시스템 및 Expression Cell

  BL21(DE3)는 recombinant protein 발현이 높으며 pET-based vector와 IPTG inducer를 사용한다. BL21-A1은 toxic protein 발현이 가능하며 T7-based vector와 arabinose를 사용한다. BL21 pLysS는 rne gene 변이로 mRNA 안정성이 증가되었으며 pCR T7-based vector를 사용한다. 각 시스템은 서로 다른 특성과 유도제를 가지고 있어 목적에 맞게 선택할 수 있다.

• 3. 단백질 발현 최적화 및 문제 해결

  E. coli에서 transformed protein 발현이 적은 이유는 rare codon 때문이다. Rare tRNA를 보충하여 해결할 수 있다. Protein misfolding은 chaperone protein이나 folding catalyst 추가로 해결 가능하다. 15~25℃의 낮은 온도에서 배양하면 세포 과정이 느려져 transcription, translation, cell division이 감소하여 protein misfolding과 aggregation을 줄일 수 있다.

• 4. Fusion Protein Tag를 이용한 단백질 정제

  MBP tag는 maltose binding protein으로 maltose 추가 시 분리된다. SUMO tag는 SUMO protease 추가로 분리된다. GST tag는 glutathione과 column에서 결합하여 분리된다. TAP tag는 calmodulin binding peptide, TEV protease cleavage site, Protein A를 포함하며 두 단계 column을 통해 정제된다. 각 tag는 서로 다른 분리 메커니즘을 가지고 있어 다양한 정제 전략을 제공한다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. Ni-NTA Agarose를 이용한 단백질 정제

  Ni-NTA Agarose는 His-tag 단백질 정제에 매우 효과적인 친화성 크로마토그래피 방법입니다. 이 기술은 높은 특이성과 빠른 정제 속도를 제공하며, 비용 효율적입니다. 그러나 비특이적 단백질 결합을 최소화하기 위해 적절한 완충액 pH와 이미다졸 농도 조절이 중요합니다. 또한 Ni2+ 이온의 누출을 방지하기 위해 정기적인 컬럼 유지보수가 필수적입니다. 대규모 정제에서는 비용 대비 효율성이 우수하며, 자동화 시스템과의 호환성도 좋아 산업적 응용에 적합합니다.

• 2. 단백질 발현 시스템 및 Expression Cell

  다양한 발현 시스템(박테리아, 효모, 곤충, 포유동물 세포)은 각각의 장단점을 가지고 있습니다. 박테리아는 빠르고 저렴하지만 단백질 폴딩 문제가 발생할 수 있고, 포유동물 세포는 복잡한 단백질 수정을 제공하지만 비용이 높습니다. 선택은 목표 단백질의 특성, 필요한 수정, 예산 및 시간 제약을 고려해야 합니다. 최근 곤충 세포와 무세포 시스템의 발전으로 더 많은 선택지가 생겼으며, 각 시스템의 장점을 활용한 최적의 선택이 중요합니다.

• 3. 단백질 발현 최적화 및 문제 해결

  단백질 발현 최적화는 배양 조건, 유도제 농도, 온도, pH 등 다양한 변수를 체계적으로 조절하는 과정입니다. 포함체 형성 문제는 발현 온도 저하나 유도제 농도 감소로 해결할 수 있으며, 독성 단백질의 경우 유도 가능한 프로모터 사용이 효과적입니다. 발현량 증가를 위해 코돈 최적화, 강력한 프로모터 선택, 숙주 균주 변경 등을 고려할 수 있습니다. 문제 해결은 체계적인 접근과 실험 설계가 필수이며, 작은 규모의 스크리닝부터 시작하는 것이 효율적입니다.

• 4. Fusion Protein Tag를 이용한 단백질 정제

  Fusion protein tag(His-tag, GST, MBP 등)는 단백질 정제를 크게 단순화하는 강력한 도구입니다. His-tag는 작고 효율적이며, GST는 용해도 증가에 도움이 되고, MBP는 단백질 안정성을 향상시킵니다. 그러나 tag가 단백질의 기능이나 구조에 영향을 미칠 수 있으므로 신중한 선택이 필요합니다. 필요시 protease를 이용한 tag 제거가 가능하지만 추가 정제 단계가 필요합니다. 다중 tag 조합 사용도 정제 효율을 높일 수 있는 전략이며, 각 tag의 특성을 이해하고 목적에 맞게 선택하는 것이 중요합니다.