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SDS-PAGE를 이용한 단백질 분리 및 검출2025.12.091. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SDS-PAGE는 SDS를 사용하여 단백질을 변성시키고 크기를 기준으로 분리하는 전기영동 기법입니다. SDS는 양친매성 물질로 단백질의 비공유 결합을 파괴하여 3차원 구조를 잃게 만들고, 동일한 질량 당 전하 비율을 가지게 하여 크기 기준으로 분리가 가능하게 합니다. 이 실험에서는 GFP 단백질을 Anion exchange chromatography로 정제한 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였으며, 예상 ...2025.12.09
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GFP 단백질 정량 실험: Lowry assay와 Extinction coefficient assay 비교2025.12.191. Lowry Assay Lowry assay는 Biuret reaction과 Folin reaction을 결합한 단백질 정량법으로, 높은 검출 감도(1 μg)를 가진다. 알칼리성 환경에서 펩타이드 결합과 Cu2+가 복합체를 형성하고, Folin reagent를 환원시켜 750 nm에서 파란색을 띤다. 본 실험에서 BSA를 표준 단백질로 사용하여 표준곡선을 작성했으며, EGFP의 질량농도는 0.45 mg/ml로 측정되었다. 그러나 Tyr, Trp, Cys 잔기 수에 따라 흡광도가 달라지고, 시약 분주 시간 차이, 빛 노출, pip...2025.12.19
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재조합 DNA 구성 및 대장균에서의 GFP 발현2025.11.121. 재조합 DNA 구성 재조합 DNA는 서로 다른 출처의 DNA 단편을 결합하여 새로운 DNA 분자를 만드는 기술입니다. 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하고 DNA 리가제로 연결하는 과정을 통해 목적하는 유전자를 벡터에 삽입합니다. 이 기술은 유전공학의 기초가 되며 단백질 생산, 유전자 치료 등 다양한 분야에 응용됩니다. 2. GFP 형질전환 GFP(Green Fluorescent Protein)는 녹색 형광 단백질로, 자외선 또는 청색광에 노출되면 녹색 형광을 발합니다. GFP 유전자를 대장균에 형질전환하면 형광 단백질을 생산...2025.11.12
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A+ 생화학실험 <12주차. Protein expression> 레포트2025.01.201. 발현 벡터 (pET vector) 발현 벡터(expression vector)는 분자 클로닝 결과로 얻은 재조합 DNA를 competent cell을 비롯한 다른 세포에 전달하는 데 사용한다. pET 벡터는 E. coli에서 재조합 단백질을 발현하기 위해 사용하는 대표적인 발현 벡터이다. pET 벡터는 플라스미드에 해당하나, 이 외에도 viral vector나 artificial chromosome 등이 발현 벡터로 사용될 수 있다. 발현 벡터의 역할을 하기 위해서는 세포 내에서 자가 복제가 가능해야 하며, 제한 효소에 의한 ...2025.01.20
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PEI 나노 복합체를 이용한 세포 내 siRNA 전달 및 RNA 간섭 평가2025.01.051. Polyethylenimine (PEI) 나노 복합체 이번 실험에서는 양이온성 branched polyethylenimine (B-PEI)를 이용해 siRNA/PEI 나노입자를 만들고, GFP-silencing siRNA를 암세포 내로 전달하여 RNA interference (RNAi) 간섭 효율을 세포 내 GFP 발현량의 감소로 확인하였다. N/P ratio에 따른 RNA 간섭 효율 변화를 살펴보았는데, N/P ratio가 높아질수록 siRNA가 더욱 응축되어 작은 나노 입자가 형성되고, 나노 입자의 표면 전하가 커져 세포막...2025.01.05
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Site-directed mutagenesis, DNA sequencing2025.01.221. GFP (green fluorescent protein) GFP는 Aequorea victoria로부터 추출한 형광 단백질로, 빛을 흡수하여 형광을 발광한다. GFP는 11개의 β-sheet가 β-barrel 구조를 이루고 있으며, barrel 내의 chromophore가 빛을 흡수하여 전자를 excitation시키고 바닥 상태로 돌아가면서 형광을 방출한다. GFPuv는 GFP의 variant 중 하나로, UV(ultra violet)을 흡수하여 형광을 방출한다. 2. Site-directed mutagenesis Site-d...2025.01.22
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Site-directed mutagenesis & DNA sequencing2025.01.181. Site-directed mutagenesis Site-directed mutagenesis는 원하는 돌연변이를 포함하는 짧은 DNA primers를 사용하여 DNA 염기서열 특정 위치의 mutation을 일으켜 돌연변이를 얻는 방법입니다. 이 방법을 이용하여 GFP의 chromophore 아미노산 서열을 변경하여 다양한 색상의 형광 단백질을 만들 수 있습니다. 2. DNA sequencing DNA sequencing은 DNA를 구성하는 염기 순서를 결정하는 작업입니다. Sanger sequencing 방법은 dNTP와 dd...2025.01.18
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GFP: 형광 단백질의 원리와 연구 응용2025.12.181. GFP(녹색 형광 단백질)의 발견과 원리 GFP는 일본 과학자 시모무라 오사무가 형광 해파리(Aequorea Victoria)에서 발견한 최초의 형광 단백질입니다. 형광은 전자가 빛에 의해 여기되어 기저 상태로 돌아올 때 가시광선을 방출하는 현상입니다. GFP의 발광 원리는 Ser-Tyr-Gly로 구성된 발색단에 기반하며, 파이 시스템의 전자가 청색광을 흡수하여 높은 에너지 상태로 여기되고 녹색광을 방출합니다. 이 발색단 아미노산은 6개의 베타 시트로 둘러싸여 보호됩니다. 2. GFP의 연구 응용 및 특성 GFP는 형광을 방출...2025.12.18
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Site-directed Mutagenesis를 이용한 GFP 돌연변이 도입 및 DNA 염기서열 분석2025.12.171. Site-directed Mutagenesis Site-directed mutagenesis는 DNA 서열의 특정 부분에 point mutation, deletion, insertion 등의 돌연변이를 도입하는 방법이다. 이 실험에서는 mutation을 포함하는 DNA primer를 이용하여 pGFPuv에 Y66H와 Y145F mutation을 도입했다. PCR을 통해 open circular DNA를 생성한 후 DpnI 효소로 메틸화된 template DNA를 선택적으로 제거하여 돌연변이를 도입한다. Pfu DNA polym...2025.12.17
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바이러스학 실험: Transfection과 Subculture2025.12.171. Transfection Transfection은 세포 내부에 외래 유전자를 인위적으로 도입하여 원하는 DNA를 발현시키는 실험 방법입니다. 본 실험에서는 polyethylenimine(PEI)을 transfection reagent로 사용했습니다. PEI는 중성 pH에서 높은 양전하 밀도를 가진 합성 polymer로, 음전하를 띤 DNA를 감싸 세포 내부로 전달하는 역할을 합니다. 293T cell line에 GFP 발현 plasmid DNA를 transfection한 결과, 형광현미경을 통해 녹색 빛을 띠는 세포들이 관찰되어...2025.12.17
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