재결합 단백질의 발현/ Expression of recombinant proteins in E. coli

문서 내 토픽

• 1. GST-tagged Proteins

  glutathione S-transferase (GST), histidine (HIS), 기타 친화성 태그를 이용하여 단백질을 정제하게 되면 기존에 잘 알려진 생화학적 특성을 가진 단백질과 알려지지 않은 생화학적 특성을 가진 재조합 단백질의 N 말단에 결합하여 정제를 도와준다. GST 단백질은 번역 시에 안정적이고 가용성이 높은 단백질로 빠르게 접히기 때문에, GST 태그를 포함하면 태그가 없을 때보다 더 잘 발현하고 용해도를 촉진하는 경우가 많다.

• 2. BCA assay

  BCA는 Lowry assay를 변형하여 만든 분석법으로, 단백질에 의해 환원된 구리 1가 이온이 BCA와 반응하여 보라색을 띄는 화합물을 만들며, Sample에 BCA Reagnt를 넣은 후 30분간 incubation하면 환원된 구리 이온의 양에 따라 용액의 색이 보라색으로 변하게 되며 구리 이온의 양에 따라 보라색의 정도도 달라진다. 이후 562 nm에서 흡광도를 측정한 후 BSA와 같은 기준단백질로 표준곡선을 그려 정량하게 된다.

• 3. IPTG

  IPTG는 lac 억제인자에도 결합하고 DNA에 대한 친화력을 크게 감소시키며 유당과 구조적으로 매우 흡사하지만, 유당과 달리 IPTG는 대사 경로에 참여하는 물질이 아니기 때문에 세포에 의해 분해되거나 사용되지 않아서, 유당보다 lac 오페론의 더 유용한 유도제로 사용될 수 있다.

• 4. 단백질 정량

  단백질 정량은 Sample에 포함된 단백질의 양을 측정하는 것을 말한다. 단백질을 정량하는 방법은 여러 종류가 있는데, 280 nm UV 흡광 측정법, Biuret assay, Lowry assay, BCA assay, Bradford assay 등이 있다. 이번 실험에서 진행한 BCA assay는 Lowry Assay를 개량하여 Folin 시약 대신에 BCA 시약을 사용한 것이다.

• 5. 세포 파쇄

  세포 내에 목표 생성물이 있다면 세포를 메디아에서 분리한 뒤 세포 내 생성물을 분리하기 위해 세포를 파쇄해야 한다. 세포를 파괴하는 방법에는 여러 종류가 있는데, 기계적인 방법과 비기계적인 방법이 있다. 이번 실험에서 사용한 장비는 초음파 분쇄기이다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

• 1. GST-tagged Proteins

  GST-tagged proteins are a widely used tool in molecular biology and biochemistry for the purification and study of recombinant proteins. The glutathione S-transferase (GST) tag is a 26 kDa protein that can be fused to the N- or C-terminus of a target protein, allowing for efficient affinity purification using glutathione-agarose beads. The GST tag can also enhance the solubility of the target protein and facilitate its proper folding. However, the large size of the GST tag may interfere with the structure and function of the target protein, and the tag must be removed before further experiments. Overall, GST-tagged proteins are a valuable technique for protein expression and purification, but researchers must carefully consider the potential effects of the tag on their protein of interest.

• 2. BCA assay

  The BCA (Bicinchoninic Acid) assay is a widely used method for the quantification of total protein concentration in a sample. It is a colorimetric assay that relies on the reduction of Cu2+ to Cu+ by proteins in an alkaline environment, followed by the chelation of the Cu+ ions by BCA, resulting in a purple-colored complex that can be measured spectrophotometrically. The BCA assay is advantageous because it is more sensitive and less susceptible to interference from common reagents compared to other protein quantification methods, such as the Bradford assay. Additionally, the BCA assay is compatible with a wide range of sample types, including cell lysates, purified proteins, and even detergent-containing solutions. However, the assay can be affected by the presence of certain compounds, such as reducing agents or chelating agents, and it is important to carefully optimize the protocol for each specific sample type. Overall, the BCA assay is a reliable and versatile method for accurate protein quantification in a variety of biological applications.

• 3. IPTG

  IPTG (Isopropyl β-D-1-thiogalactopyranoside) is a synthetic chemical inducer commonly used in bacterial expression systems to control the expression of recombinant proteins. IPTG is a lactose analog that binds to the lac repressor, relieving its inhibition of the lac operon and allowing the transcription of the target gene. This allows for tight control over the timing and level of protein expression, which is crucial for the production of proteins that may be toxic or growth-inhibitory to the host cells. IPTG is particularly useful in systems that utilize the lac promoter, such as the pET expression system, as it enables the researcher to induce protein expression at the desired time point during bacterial growth. While IPTG is an effective inducer, it is important to optimize the concentration and timing of induction to achieve the desired level of protein expression without negatively impacting cell growth and viability. Additionally, IPTG can be costly, and alternative inducers, such as lactose or autoinduction media, may be more cost-effective in certain situations.

• 4. 단백질 정량

  단백질 정량은 생물학 및 생화학 연구에서 매우 중요한 기술입니다. 단백질 정량은 실험 결과의 해석, 단백질 정제 과정의 모니터링, 효소 활성 측정 등 다양한 응용 분야에서 필수적입니다. 대표적인 단백질 정량 방법으로는 Bradford assay, BCA assay, Lowry 방법 등이 있습니다. 각 방법마다 장단점이 있어 실험 목적과 시료 특성에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다. 예를 들어 Bradford 방법은 빠르고 간단하지만 계면활성제에 민감하고, BCA 방법은 계면활성제에 강하지만 발색 반응 시간이 오래 걸립니다. 또한 단백질 표준물질 선택, 반응 조건 최적화, 간섭물질 제거 등 실험 과정에서 주의해야 할 사항들이 많습니다. 따라서 단백질 정량 실험을 수행할 때는 실험 목적과 시료 특성을 고려하여 적절한 방법을 선택하고, 실험 조건을 세밀하게 최적화해야 합니다.

• 5. 세포 파쇄

  세포 파쇄는 세포 내부의 단백질, 핵산, 소기관 등을 추출하기 위한 필수적인 과정입니다. 다양한 세포 파쇄 방법이 존재하는데, 각각의 방법은 장단점이 있어 실험 목적과 시료 특성에 따라 적절한 방법을 선택해야 합니다. 기계적 파쇄 방법으로는 소니케이션, 균질화기, 프렌치 프레스 등이 있으며, 화학적 파쇄 방법으로는 효소 처리, 계면활성제 처리 등이 있습니다. 또한 동결-해동 반복, 삼투압 충격 등의 방법도 사용됩니다. 세포 파쇄 시 주의해야 할 점은 단백질, 핵산 등의 변성을 최소화하고 효소 활성을 보존하는 것입니다. 이를 위해 적절한 완충액 선택, 저온 유지, 단백질 분해 억제제 사용 등이 필요합니다. 또한 세포 파쇄 후 불용성 물질을 제거하기 위한 원심분리 과정도 중요합니다. 결과적으로 세포 파쇄는 생물학 연구에서 필수적인 기술이지만, 실험 목적과 시료 특성에 맞는 최적의 방법 선택이 중요합니다.