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식품미생물학 및 실험 - BCP 시약을 이용한 유산균 분리

1. Date :2. Title : BCP 시약을 이용한 유산균 분리3. Objective : Bromo-cresol purple(BCP) 시약을 통해 산 생성균을 분리한다.4. Materials : micro pipet, tips, alcohol lamp, PCA agar plate, BCP, 삼각플라스크, TSB broth,MRS broth, 증류수, 저울, test tube, pipet aid 등5. Methods(1) 저울에 PCA 11.75g을 재서 삼각플라스크에 넣고 증류수를 500mL 채운다.(2) BCP 시약 0.05g을 첨가한다. [0.1g/L](3) Autoclave로 멸균한다. [121℃, 15min](4) sodium azide를 (0.1g/L) 농도로 첨가한다.(5) petri dish에 부어 굳혀 agar plate를 만든다.(6) 각각의 시료를 십진희석하여 BCP agar plate에 spreading한 후, colony를 관찰한다.※ 각각의 시료는 생장에 따른 생성물질이 다름.6. Results(1) Bacillus cereus(2) Cronobacter sakazakii(3) 요거트제품 (Bio)7. Discussion배양과정에서 탄소원 영양분을 분해하여 젖산(Lactic acid)을 생성하는 유산균은 중성 pH의 배지를 최적배양조건인 37℃, 18시간 이상으로 배양하면 산 생성에 따라 산성농도로 변화시키는 성질이 있다. Bromo-cresol purple은 이러한 성질을 이용하여 유산균의 colony가 선택적으로 색 변화가 형성되게 하여 검출을 가능하게 하는 산/염기 지시약이다. 이번 실험에서는 BCP 시약이 첨가된 Agar배지에 유산균을 접종하여 색 변화를 통해 직접 유산균을 검출해보는 것에 의의가 있다.BCP 시약은 pH 5.2~6.8의 산성 조건에서 황색, 그 이상의 염기조건 pH에서는 보라색을 띄는 변색역을 가지고 있는데, 유산균에 의해 배지가 산성조건으로 변할 시에는 유산균 colony가 황색을 띄게 된다. 이 때 사용하는 배지는 식품 및 음용수로부터 일반 세균의 총균수 분석에 사용되는 PCA(Plate Count Agar)며, 유산균 수의 측정은 일반적으로 시료를 연속해서 십진 희석하여 배지에 일정량을 스며들게 한 후에 배양시켜 그 수를 count한다. 왜냐하면, 시료 중에 함유된 세균의 수는 직접 측정하기에는 너무 많기 때문이다. 이 희석액을 고체 평판 배지에 접종하여 배양하면 한 개의 세균은 눈에 보이는 colony를 형성하게 되므로 이 colony 수를 측정하면 희석액 중에 함유된 세균 수를 알 수 있고, 이것의 희석배수를 곱하면 시료 중에 존재하는 생균수를 알 수 있다.이번 실험에 사용한 세균은 Bacillus cereus, Cronobacter sakazakii, 요거트 제품(Bio) 3가지로, 유산균에 해당하는 요거트 제품을 제외한 Bacillus cereus와 Cronobacter sakazakii에서도 colony에 발색이 나타난 것으로 보아 이 두가지 세균도 유산균처럼 당을 이용하여 산을 생성함으로서 배지의 pH를 낮춘다는 것을 추측할 수 있다. 실제로, Bacillus cereus의 경우는 gram 양성균이면서 통성호기성균으로, 식품 (특히, 식물 유래의 원료)의 당을 이용하여 증식하면서 만들어내는 독소에 의해 pH가 어느 정도 변화가 생기며, Enterobacter 계열인 Cronobacter sakazakii의 경우는 gram 음성균이면서 구연산염 및 초산염을 탄소원으로 이용하여 pH를 낮추게 된다.8. Further study(1) BCP 이외의 검출에 사용되는 시약의 종류를 간단하게 서술하시오.=> 박테리아를 검출하는 방법은 Bromo-cresol purple과 같은 Indicator 지시약을 사용하여 주로 색 변화를 관찰하는 것이 대부분이다. 이러한 시약은 SS, Mac, DCA 등의 neutral red나 pH의 변화에 따라 황색부터 붉은색의 범위를 띄는 phenol red, 모든 결핵균 배지에서 사용하는 malachite green, 대장균군 검사용 배지(EMB 배지)에서 사용하는 methylene blue 등이 있다.(2) gram 양성균과 음성균의 특징을 서술하시오.=> 그람양성균(Gram positive bacteria)은 원핵생물 중에서 그람염색법에 의해 세포벽이 보라색으로 염색되는 세균을 말한다. 그람양성균은 세포막 밖에 ‘peptidoglycan’이라는 세포벽으로 두껍게 둘러싸여 있고, 이것이 여러 겹으로 구성되어 있기 때문에 Crystal violet과 같은 염기성 염료로 염색한 후, 에탄올로 씻어내도 탈색되지 않고 보라색을 띌 수 있다. 그람양성균의 세포벽에는 ‘테이코산’이라는 산성 물질이 있는데, 인산기가 음전하를 띄기 때문에 세포 표면을 음전하로 만들어 2가 양이온이 세포벽에 결합하는 기작이 된다. 반대로, 그람음성균(Gram negative bacteria)은 원핵생물 중, 그람염색법에 의해 사프라닌을 통한 반대염색으로 붉은 색을 띄는 세균을 말한다. 그람양성균에 비해서 매우 얇은 peptidoglycan과 outer membrane이 합쳐져 있는 세포벽을 구성하며 이들은 서로 지질단백질과 결합하고 있고, 테이코산은 없다. 그람양성균은 두꺼운 세포벽으로 인해 Crystal violet이 에탄올에 씻겨나가지 않는 반면, 그람음성균은 Crystal violet으로 염색하고 요오드를 처리하면 peptidoglycan과 같은 다당류는 에탄올에 탈색되지 않아 자주색으로 염색된다. 이 때, 에탄올에 의해 탈색된 균은 사프라닌을 통한 염색으로 붉게 만들어 그람양성균과 분류시킬 수 있다.

자연과학| 2020.02.01| 4페이지| 1,000원| 조회(474)

분리, 미생물, 원주, 식품, 유산균, 시약, 미래, 연세, BCP

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식품미생물학 및 실험 - 세균의 동정_미생물의 당 이용 패턴 (API kit)

1. Date :2. Title : 세균의 동정 - 미생물의 당 이용 패턴 (API kit)3. Objective : API 50 CHL kit를 이용하여 분리한 세균을 동정한다.4. Materials : 순수 분리된 미생물, 백금이, API 50 CHL kit, Mineral oil,micro pipet, alcohol lamp 등5. Methods(1) MRS plate 순수 분리된 colony를 백금이를 이용하여 채취(2) API 50 CHL Media에 채취한 균을 풀어준다.(3) pipet을 이용하여 pipeting 해준다. [vortexing 불가](4) API kit 바닥에 물을 부은 후 물을 버리고 물기를 조심스럽게 제거한다.[단, hole에는 물이 있도록 해야 한다.](5) Strip을 올린다.(6) API kit를 기울인 상태에서 1000ul pipet으로 기포가 생기지 않도록 균을 푼 CHL media를 넣는다.(7) Mineral oil이 위로 볼록 올라올 때까지 떨어뜨린다.(8) Incubator(37℃)에 24시간, 48시간 배양 후 측정하여 결과를 확인한다.6. Results(1) API 50 CHL (Lactobacillus 계열 동정에 사용)(2) API 20E (E.coli 동정에 사용)7. Discussion미생물의 동정은 혼합시료 및 채집 샘플로부터 순수하게 분리한 미생물이 어떤 종인가를 알아내는 과정을 말하며, 형태학적인 면이나 미생물의 기능성을 이용해서 구분하는 법 등 여러 방법이 존재한다. 최근에는 정확한 동정을 위해 각 미생물마다 독특한 염기서열을 분석함으로써 찾아내는 분자생물학적 방법이 주로 사용된다. 이번 실험에서 사용한 API kit는 미생물이 어떤 대사를 하고 어떤 물질을 이용하며 살아가는지, 또한 발효과정을 거치면서 어떠한 대사산물을 내놓는지를 발색 시약이나 탁도 및 pH 변화를 지켜봄으로서 그 결과를 토대로 동정하는 방식이다. API kit의 종류 중 하나인 API 50 CHL을 사용하여 분리한 세균을 직접 동정해보는 것이 오늘 실험의 목표이다.API kit는 크게 Biochemical test, Assimilation test, Fermentation test 3가지 방식으로 나눌 수 있다. 먼저, Biochemical test는 saline 용액에 시험균을 현탁하여 건조된 기질이 들어있는 kit의 cupules에 접종하여 배양 후 발색 시약을 첨가하여 물질대사 유무를 색의 변화로 판단한다. Assimilation test는 최소 배지에 현탁한 시험균을 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 kit의 cupules에 접종/배양한 후, 시험균이 이 당을 이용할 수 있는지를 탁도 변화로 판정하는 방법이다. 마지막으로, Fermentation test는 당으로부터 산을 생산하였을 때의 pH 변화로 판정하는 방법이다. 이번 실험에서 쓰인 API 50 CHL kit는 49종류의 당 test를 통해 Lactobacillus계열의 미생물을 동정할 수 있다.API kit를 통한 동정법은 결과를 API web이라는 인터넷 사이트에 접속하여 음성/양성 판독을 기록하여 알아보는 방식이므로 정확도가 꽤 높지만, 같은 시료 및 환경에서 실험을 진행하여도 다른 실험결과가 유도될 때가 있다. 이에 대한 원인으로 가장 가능성이 높은 것은 오염의 경우이며, 일반적인 실험에서 가장 빈번하게 발생한다. target 미생물이 아닌 외부 다른 미생물에 의해 오염이 발생하거나 kit의 불량, 실험자의 조작 실수 등으로 발색이나 탁도 변화가 다른 실험자들의 결과와 다르게 나타날 수 있기 때문에 단 한번의 test만으로 가부를 결정짓는 것은 금물이다. 여기서 kit에 미생물이 있는 media를 접종할 때, 기포가 생기는 것을 방지하기 위하여 kit 옆면을 따라 흐르도록 깊숙하게 천천히 채워주는 것이 중요하다. 만약, 기포가 생겼다면 억지로 접종시키려하기보다 다시 pipette으로 빨아들이고 다시 한 번 재접종하는 것이 좋다.8. Further study(1) API 50 CHL을 통한 동정에서 Cronobacter sakazakii가 검출되지 않은 이유와 API 20E를 통한 동정에서는 검출된 것을 토대로 각각의 kit 사용 용도와 numbering tube에 포함된 건조된 기질의 특성을 각각 조사하시오.=> API kit는 동정하고자 하는 target 미생물의 종류에 따라서도 구분할 수 있다. 크게 장 내 세균 즉, Gram 음성 간균의 동정에 사용되는 API 20E, 장 내 세균 이외의 Gram 음성 간균 동정에 사용되는 API 20NE, Bacillus와 Lactobacillus의 동정에 사용되는 API 50 CH, 효모의 동정에 사용되는 API 20C AUX로 나눌 수 있다. Cronobacter sakazakii는 장 내 서식하는 Gram 음성균인 Enterobacteria이므로 E.coil와 유사한 특성을 가지기 때문에, API 20E에서는 제대로 검출된 반면에, Lactobacillus계열을 target으로 하는 API 50 CHL에서는 검출되기 힘든 것이다.API 50 CHL은 당 이용 여부를 탁도 변화로 판정하기 때문에 numbering tube에 포함된 건조 기질은 탄수화물만이 유일한 탄소원으로 되게 구성되어 있는 반면, API 20E는 Biochemistry test이기 때문에 원자의 이용도 차이를 보는 것이므로 peptone, 황화수소 등 다양한 물질의 기질이 발색시약과 함께 첨가되어 있다.

자연과학| 2020.02.01| 4페이지| 1,000원| 조회(314)

미생물, 당, 세균, 원주, 식품, 미래, 연세, API, 동정, bacteria

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식품미생물학 및 실험 - plaque assay에 의한 bacteriophage 분리실험

1. Date :2. Title : plaque assay에 의한 bacteriophage 분리실험3. Objective : C.sakazakii의 bacteriophage를 분리한다.4. Materials : micro pipet, pipet tips, TSB soft agar, TSB agar, C.sakazakii, SM buffer,centrifuge, TSB broth 등5. Methods(1) TSB agar, TSB soft agar(0.7%), TSB broth, SM buffer를 만든다.(2) 제조한 TSB broth에 host를 배양한다.(3) 토양시료에서 분리한 sample을 2.5g, TSB broth 22.5mL를 섞고 배양한 host를 100ul씩 분주한다.(4) Shaking incubator에 overnight시킨다.(5) centrifuge 한다. [18000*g, 5min](6) TSB broth에 host(B.cereus)를 배양한다.(7) EP tube에 SM buffer를 각각 900ul씩 분주한다.(8) 준비된 phage를 EP tube에 100ul 넣어 십진희석 한다. [원액~10^-4]TSB soft agar에 host(B.cereus)를 100ul 넣고,십진희석한 phage를 100ul 넣어 TSB plate에 중층한다.(9) 37℃에 24hr 정도 배양한다.6. Results※ PFU ? Plaque Forming Unit (PFU/mL)=> 농도 : Plaque수 * 희석배수 * Agar(0.1mL -> mL기준 역수)Ⅰ. 농도 = 74 * 10^6 * 10 = 7.4 * 10^8 (PFU/mL)Ⅱ. 농도 = 75 * 10^6 * 10 = 7.5 * 10^8 (PFU/mL)Ⅲ. 농도 = 81 * 10^6 * 10 = 8.1 * 10^8 (PFU/mL)※ 원액 농도 = (Ⅰ+Ⅱ+Ⅲ)/3 ≒ 7.7 * 10^8 (PFU/mL)7. DiscussionPlaque assay(용균반 검사법)이란, 바이러스의 역가(titer)를 측정하는 정량분석법의 일종으로, 초기 박테리오파지 연구를 위해 개발되었다가 1952년경부터 동물을 target으로 삼는 바이러스 연구가 가능하도록 수정 되어, 현재는 다양한 바이러스에 응용되고 있는 방법이다. 이번 실험에서는 C.sakazakii균을 숙주로 삼는 박테리오파지의 감염성을 관찰하기 위해 plaque assay를 통하여 바이러스에 감염된 C.sakazakii균과 그렇지 않은 균을 분리하고 희석하기 전의 원액의 박테리오파지 농도를 계산해보는 것이 목적이다.Plaque(용균반)는 바이러스가 숙주세포에 감염하고 증식하면서 세포를 사멸시키고 방출되어 형성되는 것으로, 세포가 사멸된 영역이 주로 원형이 된다. 다시 말해, 이것은 바이러스 증식이 원인이 되어 세포사멸이 진행된 영역을 의미하기 때문에 바이러스에 감염된 미생물 세포의 분포를 눈으로 관찰할 수 있게 된다. 박테리오파지는 감염 후, 세포사멸로 죽이고 나오면서 증식된 바이러스가 다시 주변 세포들을 감염시키고 후에 주변 세포 역시 세포사멸로 죽는 과정이 반복된다. 이 때, 감염과 세포사멸 반응이 어느 정도 반복되면 최초로 감염된 세포를 중심으로 plaque가 형성되게 된다. 다시 말해, 바이러스가 증식과정에서 세포사멸을 유도할 수 없을 경우에는 용균반이 형성될 수 없으므로 이 경우에는 plaque assay를 시행할 수 없다.실제로 plaque assay를 수행하기 위해서는 바이러스 시료를 바이러스가 거의 나오지 않을 때까지 계열희석(serial dilution)시켜야 하며, 이것은 바이러스의 역가가 높을 경우에 용균반이 서로 겹쳐져 정확한 plaque count를 세기 힘들기 때문이다. 통계적으로 유의미한 개수는 시료당 30~100개 정도이며, 희석액을 세포에 감염시키고 난 후에는 Agar로 덮어준다. Agar는 여기서 생성된 바이러스가 세포배지 전체로 확산되지 않고 주변 세포들만 감염시키도록 하는 역할을 수행함으로서 용균반이 효과적으로 생성되게 도와준다. 이 때 첨가한 Agar와 계열희석배수는 원 시료에 들어있던 역가 PFU(Plaque Forming Unit)의 계산에 영향을 미치게 된다.이번 실험에서는 보다 정확한 역가계산을 위해 3번의 실험에서 나온 plaque수를 세어 평균값을 계산해서 원액의 농도를 예측하였다. plaque가 형성되지 않은 나머지 부위를 잔디가 깔린 모습과 유사하여 lawn이라고 부르며, plaque counting을 보다 용이하게 하기 위해서 Neutral red나 Crystal violet과 같은 vital dye로 세포 단층을 염색하여 감염되지 않은 세포가 색을 흡수하도록 유도하기도 한다.8. Futher study(1) Lytic phage와 Lysogenic phage의 생활사에 대하여 조사하시오.=> 바이러스는 먹이가 되는 숙주세포를 죽이느냐 아니면 같이 기생하며 살아가느냐의 차이에 따라 용균성(Lytic) 혹은 용원성(Lysogenic)으로 나뉜다. 용균성의 경우는 숙주세포에 감염된 후에 증식과정 도중 숙주세포의 파괴가 발생해서 내부에 있던 바이러스가 다시 주변 세포로 감염된다. 이번 실험에서 사용한 박테리오파지는 이런 생활사를 거치며, 파지의 캡시드 내부에 있던 핵산이 유입되면서 숙주세포의 DNA는 분해된다. 유입된 핵산은 숙주세포의 효소를 통해 박테리오파지의 단백질을 생성하고 새로운 파지를 만들며 시간이 지나면 숙주세포의 세포막을 파괴하는 효소가 만들어져서 세포사멸이 된다.반대로, 용원성의 경우는 감염되면 숙주세포를 파괴하지 않고 세포 내에서 바이러스의 유전자가 복제되는 기작을 가진다. 용균성 생활사와 용원성 생활사를 모두 거치는 박테리오파지는 ‘온건성파지’라고 부르며, 대표적으로 람다파지(Lambda phage)가 있다. 용원성은 바이러스가 숙주세포에 부착하고 핵산을 주입하면 유전물질이 숙주세포 내에서 고리형태를 띈다. 이것은 숙주세포의 DNA 사이로 삽입되어 숙주세포의 DNA와 함께 복제되기 때문에 숙주세포를 파괴하지 않고 복제하는 생활사를 가질 수 있다.(2) Bacteriophage의 one-step growth curve에 대해 조사하시오.=> 숙주세포를 배양하여 박테리오파지를 감염시켜 바이러스의 증식에 따른 수를 정량적으로 측정할 수 있다. 세균의 growth curve를 측정하던 CFU와 동일한 개념으로, 바이러스에서는 PFU로 표시하게 된다. 여기서 측정한 바이러스는 비리온의 개수인 것이 중요하다.

자연과학| 2020.02.01| 4페이지| 1,000원| 조회(657)

분리, 미생물, 원주, 식품, 미래, 연세, phage, bacteria, plaque, 파지

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식품미생물학 및 실험 - 미생물의 항생제 내성실험

1. Date :2. Title : 미생물의 항생제 내성실험3. Object : 유산균이 항생제에 대한 내성을 가지고 있는지 알아본다.4. Materials : 미생물 배양액, Ampicillin, Neomycin, Erythromycin, Streptomycin, Gentamycin,micro pipet, pipet tips, alcohol lamp, MRS soft agar, MRS plate, water bath,멸균 핀셋 등5. Methods(1) Soft agar를 100mL 제조한다.[Agar는 증류수 양의 0.8%](2) 제조한 Soft agar를 test tube에 5mL씩 분주한다.(3) Soft agar를 Autoclave한다.[121℃, 15min](4) 멸균된 Soft agar를 60℃의 water bath에 넣는다.(5) Soft agar에 미생물을 접종하고 Agar plate에 중층한다.(6) 중층한 Soft agar가 어느 정도 굳었을 때 항생제가 묻어있는 disc를 올린다.(7) Incubation[30℃, 24hr]6. Results※ 24hr 배양한 유산균과 4종류의 항생제 투여에 따른 clear-zone 형성▶ C : Colistin▶ E : Erythromycin▶ G : Gentamycin▶ S : Streptomycin7. Discussion항생제(Antibiotic)이란, 세균을 죽이거나 세균의 생장을 억제시키는 약을 말하며, 이는 원래 자연에서 발견된 미생물이 다른 미생물을 억제하기 위해 생산해내는 물질이다. 최근에는 과학기술의 발전으로 인해 다양한 항생제들을 개발하고 합성하여 시판하는 추세이며, 물질 그대로가 아니라 높은 배율로 희석해서 사용하더라도 효과가 대단히 크다는 점에서 매우 유용하다고 할 수 있다. 하지만, 박테리아는 항생제 내성이라는 것을 통해 다수의 항생제 투여에도 죽지 않고 생존하게 되어 현재는 인류 건강의 큰 위험으로 작용하고 있다. 이번 실험에서는 자연계에서 존재하는 실제 유산균을 다양한 항생제를 투여하고 배양시켜봄으로서 항생제 저항이 있는지의 정도를 관찰하는 것이 목표다.항생제 내성의 원인은 당연하게도 항생제를 사용하기 때문에 발생하며, 세균의 유전적 변이가 발생한 돌연변이 미생물에 의해 항생제 노출에도 살아남을 수 있는 저항균 보유 균주들이 생겨난다. 이것이 지속적으로 증식하면 내성력이 점점 강해진 병원균이 생겨나므로 더욱 강력한 항생제를 치료에 사용할 수밖에 없기 때문에 최종적으로는 ‘슈퍼 박테리아’라고 불리는 모든 항생제에 저항을 가지는 세균이 생겨난다. 항생제에 노출된 미생물(박테리아, 진균류 등)은 자기복제 과정에서 내성을 갖는 형질을 선택하게 되고, 이렇게 생겨난 저항성 유전자를 다른 미생물들에게 전달하여 이들도 동일한 내성을 갖게 하는 것이 원리다.미생물이 자라는 배지에 항생제를 투여했을 때, 항생제 내성이 없다면 항생제 주변에는 미생물이 자랄 수 없기 때문에 둥근 투명판이 형성되게 된다. 이것을 ‘clear-zone'이라고 부르며, 크기가 클수록 항생제가 해당 미생물에 작용하는 힘이 크다고 생각할 수 있다. 반대로, 항생제에 대한 저항성을 가지고 있다면 clear-zone의 크기가 매우 작거나 아예 없을 수도 있다.실제 실험에서 사용한 4가지의 항생제 중, Erythromycin은 4번의 실험 모두 clear-zone이 존재하지 않는 것을 통해 유산균이 이것에 대한 내성을 가지고 있음을 추측할 수 있다. 나머지 3종류의 항생제 효과는 육안상 비슷하지만, 각 항생제 종류마다 미생물의 감수성에 차이가 있기 때문에 미생물의 lawn 형성이 미세한 차이를 보인다.8. Further study(1) Antibiotics의 종류 및 작용기작에 대해 서술하시오.=> 항생제는 항균영역 혹은 작용기작에 따라 분류할 수 있으며, 여기서 항균영역은 항생제가 어떤 종류의 세균에 효과적인지를 의미한다. 일단 첫 번째로 세포벽 합성을 억제하는 항생제는 주로 베타락탐계 (페니실린, 세팔로스포린 등) 혹은 반코마이신이며, 세균이 생존하는데 필수적인 기능을 하는 세포벽의 각 합성단계를 억제하여 세균을 죽인다. 두 번째는 세포막의 기능을 억제하여 세포막 투과성의 변화를 주는 것으로, 선택적 능동수송을 억제시켜 세포를 사멸시킨다. 이것은 암포테리신, 케토코나졸 등의 항진균제 혹은 그람 음성균에 작용하는 폴리믹신 등이 있다. 세 번째는 단백질 합성을 억제하는 방법으로 항균작용을 나타내게 되는데, 사람의 리보솜과 세균의 리보솜은 구성에 차이가 있어 항생제 영향을 다르게 받는다. 아미노글리코사이드, 테트라사이클린, 클로람페니콜 등의 계열이 이러한 작용기작에 해당한다. 네 번째는 핵산의 합성을 억제하여 세균증식을 막게 되며, RNA 합성을 방해하는 리팜핀, DNA gyrase와 결합하여 기능을 억제하는 퀴놀론계 항생제 등이 있다. 마지막으로, 핵산합성의 중요한 전구물질인 엽산의 합성 억제도 항생제 기작으로 작용한다. 인간은 엽산을 외부 음식을 통해 섭취해야하는 반면, 세균은 자체 생합성을 하기 때문에 선택적 항균력을 보이게 된다. 설포아미드, 트리메소프림 등과 병행하여 사용하면 상승효과를 볼 수 있다.(2) 인체에 유해한 병원성 미생물과 그 미생물이 분비하는 독소=> 병원성 미생물이란, 인간 혹은 동/식물에 기생하며 각종 유해 물질을 유발하는 미생물들을 말한다. 이들이 만들어내는 독소는 숙주의 조직을 직접적으로 공격하거나 세포대사 혹은 면역체계를 방해하는 기작을 가지며, 미생물의 세포 배출 여부에 따라 크게 외독소(Exotoxin)와 내독소(Endotoxin)로 나뉜다. 외독소의 경우는 디프테리아균, 파상풍균 등 다양한 병원성 미생물이 분비하는데, 항원-항체 반응이 가능하여 열처리 혹은 화학처리 등을 통해 불활성화 시킨 변독소(toxoid)를 활용하여 백신을 만들 수 있다. 특히, 보툴리눔 독소는 치명적인 독소지만, 적정 농도로 낮춰서 사용하면 사시, 근육 긴장이상 등의 치료나 주름 개선 등에 효과적이다. 내독소는 티푸스균, 콜레라균 등의 독소처럼 세균 세포 내에 보유되어 확산이 일어나지는 않으나, 균이 사멸/파괴되면 균체 외로 유출된다. 외독소에 비해 독성이 약하며 균종에 따른 특이성이 적지만, 열에 대한 저항력이 강하고 생체에 주사해도 외독소처럼 독소를 중화시킬 항체를 생성하지 않는다.

자연과학| 2020.02.01| 4페이지| 1,000원| 조회(482)

미생물, 항생제, 원주, 식품, 유전자, 미래, 연세, 내성

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식품미생물학 및 실험 - Bacteria의 O.D값 측정을 통한 growth curve 작성

1. Date :2. Title : Bacteria의 O.D값 측정을 통한 growth curve 작성3. Object : 배양액의 흡광도를 측정함으로써 미생물의 생장을 측정해본다.4. Materials : 미생물 배양액, TSB broth, 96 well plate, micro pipet, alcohol lamp,pipet tips, micro plate reader 등5. Methods(1) 멸균된 상태의 액체 배지에 Host 100ul를 접종하여 키운다. (37℃)(2) 접종 후 시료를 무균조작 방법으로 200ul를 96 well plate에 채취하여 흡광도를 측정한다.(3) 10분 단위로 흡광도를 측정하여 흡광도의 변화를 chart로 그린다.[Excel 사용 - 1시간 30분 진행](4) Host의 growth curve를 완성한다.6. Results※ 실제 O.D값 : 전체(Y축) O.D값 - BHI medium의 O.D값7. Discussion미생물은 식물과 동물에 비해 매우 단시간에 증식하는 특성을 가지고 있으며, 이것을 배양시간과 생균수의 대수(log) 사이의 관계를 나타낸 그래프를 ‘Growth curve’라고 한다. 이 생장곡선을 관찰하기 위해 측정하는 방법은 여러 가지가 있지만, 세포를 대량 배양하거나 조사해야할 표본의 수가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정하여 Growth curve를 관찰하게 된다. 미생물의 배양액에 일정한 파장의 빛을 투과시켰을 때, 용액이 그 빛을 흡수하게 되는데 이 때 흡수된 빛의 양이 용액의 세포농도에 비례하게 된다. 즉, 세균수의 증가에 따라 흡광도 역시 증가하는 반면, 투과된 빛의 양은 반비례한다.이처럼 빛을 모노크로미터에 의해 단색화 되어 시료의 용액에 투과시켜 흡광도를 측정하는 방법을 ‘분광 광도법’이라고 하며, 주로 자외선 및 가시광선 영역의 빛을 사용하게 된다. 이번 실험에서는 540nm의 가시광선을 사용하였고, 그래프의 Y축에 해당하는 O.D(Optical Density)값은 일정한 세기를 가진 어떤 파장의 빛이 용액층을 통과한 후에 투과 정도를 의미한다. 이 때, 광밀도(O.D)는 log10{(조사된 광량)/(투과한 광량)}이기 때문에 불투명할수록 그 값이 커진다. 실험에서 주의해야 하는 점은 96 well plate에 시료를 넣을 때, 기포가 생기는 일이 빈번한데 이것을 피펫으로 그냥 터뜨리려고 하면 잘 터지지 않지만 화염멸균을 한 피펫으로 살짝 누르면 기포를 쉽게 제거할 수 있다. 또한, 흡광도를 측정하는 기계는 매우 민감하기 때문에 결과값의 오차를 최소화하기 위해 피펫이 96 well plate의 밑면을 건드리지 않게 시료를 넣어야 하고, 반드시 plate의 옆을 잡아서 빛이 투과하는 밑면에 영향이 가지 않도록 하는 것이 중요하다. 마지막으로, 시료 자체에도 존재하는 O.D값은 데이터에서 언급한 것처럼 그래프의 O.D값에서 시료의 배양액 O.D값을 뺀 값이므로 미생물이 존재하지 않는 배지 역시 96 well plate에 접종하여 흡광도를 측정해야 한다.8. Further study(1) Cronobacter sakazakii의 흡광도를 540nm의 파장에서 측정한 이유는?=> 흡광도 O.D값은 A=log(I?/I) [I? : 조사한 빛의 세기, I : 투과한 빛의 세기]이며, 이 흡광도는 빛의 진로에 있는 분자 수에 의해 결정되므로 Mol흡광도로 환산할 수 있다. 이 때, Mol흡광도는 빛이 통과하는 시료의 농도와 용기의 길이에 영향을 받으며, e=A/CI [C : 농도(M), I : 용기의 길이(cm)]로 나타낼 수 있다. 이것이 Ultraviolet-visible spectrophotometer(자외선 분광 광도계)에서 광자의 흡수가 증가한 그래프인 봉우리 모양으로 나타나며, 자외선 혹은 가시광선 스펙트럼의 흡수가 최대로 되는 파장을 λmax(Lambda max)라고 한다. 이번 실험에서는 흡광도에 쓰이는 540nm 파장의 빛이 λmax가 최대치가 되기 때문에 흡광계수 역시 최대치가 되는 540nm를 사용한 이유다.(2) 미생물의 growth curve에 대해 자세히 설명하시오.=> 미생물은 이분법을 비롯한 세포분열을 통해 집단의 증식이 이루어지고, 이것을 배양할 때는 일반적으로 호분배양 및 닫힌계를 이용하게 된다. 결국, 배양하는 동안 새로운 배지의 첨가 혹은 미생물의 배출이 일어나지 않는 닫힌계에서는 영양물질은 감소하고 노폐물의 양은 증가한다. 이와 같이 번식하는 미생물의 생장과정은 데이터와 유사한 growth curve가 나타나며, 각 phase별로 나눌 수 있다.Ⅰ. Lag phase세포분열이 즉각적으로 발생하지 않기 때문에 Biomass의 증가도 없지만, 분열에 필요한 새로운 구성성분을 합성하는 시기이다. 분열에는 ATP, 필수 보조인자, 리보솜 등 영양물질을 사용하는데 필요한 효소가 없다면 이를 반드시 합성해야 하며, 이 시간은 접종균의 대사량, 노후도, 배지의 특성 등에 따라 다르다.Ⅱ. Exponential phase미생물이 배지의 조성 및 생장조건 하에서 분열할 수 있는 최고의 속도로 성장하고 분열하는 시기이다. 각각의 세포가 조금씩 다른 시간에 분열하기 때문에 생장곡선이 실제로는 증가율이 일정하지 않은 곡선을 그리며 증가하게 된다. 이 시기의 모든 집단 세포는 화학적, 생리적 규칙이 가장 균일하기 때문에 연구에서 주로 이 시기의 세포를 사용한다.

자연과학| 2020.02.01| 4페이지| 1,000원| 조회(676)

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