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His-tag 단백질 정제 실험2025.12.091. 단백질 Tag의 개념 및 종류 단백질이나 펩타이드에 붙는 tag는 융합 단백질을 만들기 위한 말단 꼬리표이다. 주요 종류로는 단백질 A tag, (His)6 tag, 글루타싸이온-S-전달효소(GST) tag, 말토오스 결합 단백질(MBP) tag 등이 있으며, 각각 특정 물질과의 결합 특성에 따라 구분된다. Tag는 특정 리간드와 높은 친화력을 가진 펩타이드나 단백질을 코딩하는 유전자로 만들어지며, 표적 단백질의 아미노 말단이나 카복시 말단에 부착된다. 2. His-tag를 이용한 단백질 정제 (His)6 tag는 Ni2+와 ...2025.12.09
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A+ 생화학실험 <13주차. His6-tagged Protein Purification> 레포트2025.01.201. 단백질 정제 단백질 정제(Protein Purification)는 생물학적 연구 및 산업적 응용을 위하여 단백질을 혼합물로부터 분리하고 정제하는 과정이다. 이 과정은 일반적으로 여러 단계를 거치며, 각 단계에서는 단백질의 용해도, 크기, 전하, 결합 친화도 등의 단백질 간 서로 다른 특성을 활용하여 단백질을 분리한다. 첫 번째 단계는 세포 용해(Cell Lysis)로, 세포벽을 파괴하여 세포 내의 단백질을 방출하는 것이다. 다음 단계는 affinity chromatography이다. 이 방법은 특정 단백질에 결합하는 리간드를 ...2025.01.20
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Ni-NTA 친화성 크로마토그래피를 이용한 His-tagged 단백질 정제2025.11.161. Ni-NTA Agarose를 이용한 단백질 정제 6x-His tagged protein을 Ni-NTA agarose 수지를 이용하여 chromatography를 통해 정제한다. Histidine의 imidazole ring의 N 2개가 NTA에 결합된 Ni 원자에 결합하여 단백질이 정제된다. Washing buffer와 elution buffer에 포함된 imidazole은 competitive agent로 작용하여 contaminant protein과 bead의 결합을 줄이고 최종 순도를 높인다. 실험 결과 약 70kDa의 ...2025.11.16
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SDS-PAGE를 이용한 단백질 분리 및 검출2025.12.091. SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) SDS-PAGE는 SDS를 사용하여 단백질을 변성시키고 크기를 기준으로 분리하는 전기영동 기법입니다. SDS는 양친매성 물질로 단백질의 비공유 결합을 파괴하여 3차원 구조를 잃게 만들고, 동일한 질량 당 전하 비율을 가지게 하여 크기 기준으로 분리가 가능하게 합니다. 이 실험에서는 GFP 단백질을 Anion exchange chromatography로 정제한 후 SDS-PAGE를 통해 분석하였으며, 예상 ...2025.12.09
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His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제2025.12.171. eGFP 단백질 발현 및 정제 His tagged eGFP 단백질을 E.coli BL21(DE3) 시스템에서 과발현시키고 affinity chromatography를 통해 정제하는 과정. pET28a(+) vector에 eGFP 유전자를 클로닝하고 IPTG로 유도하여 6x His tagged eGFP를 과발현. Sonication으로 세포를 파괴하고 His tag와 니켈 이온의 친화성을 이용한 정제. Ultrafiltration으로 농축하여 최종 정제 단백질 획득. 2. 단백질 정량 방법 비교 Extinction coeffic...2025.12.17
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생명과학실험1 Immunoprecipitation (IP)2025.01.171. Immunoprecipitation (면역침강법, IP) 면역침강법은 항원-항체 반응을 이용하여 원하는 단백질을 분리하고자 하는 실험이다. 단백질은 특정한 항체에만 결합하는 항체 특이성을 가지고 있으므로, 검출하고자 하는 target protein도 특정한 종류의 항체와만 결합하게 된다. 항원-항체 복합체가 바닥에 가라앉도록 하기 위해서 먼저 항체와 Bead를 붙이고, bead와 결합한 항체가 다시 단백질과 결합하여 단백질-항체-Bead 복합체를 형성하게 된다. 이 복합체가 원심분리를 통해 침강하게 되면서 원하는 단백질을 분리...2025.01.17
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6XHis-tagged eGFP 발현, 정제 및 특성 분석2025.12.141. Green Fluorescent Protein (GFP) 및 enhanced GFP (eGFP) GFP는 해파리 Aequorea Victoria에서 발견된 단백질로 238개의 아미노산으로 이루어져 있으며 27kDa의 크기를 가진다. eGFP는 GFP의 64번 아미노산인 Phenylalanine을 Leucine으로, 65번 아미노산인 Serine을 Threonine으로 변형한 형태로, 더욱 강한 형광을 나타낸다. eGFP는 488nm에서 excitation하고 509nm에서 emission하며, 26.9kDa의 monomer 크...2025.12.14
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대장균에서 재조합 단백질 생산 및 정제2025.01.131. 재조합 단백질 생산 대장균 BL21(DE3) 균주는 재조합 단백질 고발현에 널리 사용되며, lac 프로모터와 T7 프로모터를 이용하여 IPTG 유도 하에 단백질을 발현할 수 있다. 본 실험에서는 pET28a 벡터를 사용하여 His-tag 융합 단백질을 생산하고, Ni-NTA 친화성 크로마토그래피와 FPLC를 통해 단백질을 정제하는 방법을 익혔다. 2. 단백질 분석 SDS-PAGE를 통해 단백질 크기별 분리와 정제 과정을 확인하였고, Bradford assay로 단백질 농도를 정량하였다. 또한 DES와 OASS 효소 활성 측정을...2025.01.13
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6x His tagged eGFP의 과발현, 정제 및 정량 분석2025.12.191. 단백질 발현 및 정제 기술 6x-His tagged eGFP를 pET28a(+) 플라스미드 벡터를 이용하여 BL21(DE3) 숙주 세포에서 과발현시켰다. IPTG 유도제를 사용하여 Lac operon을 활성화하고 T7 RNA polymerase를 통해 고효율 전사를 달성했다. Sonication으로 세포를 파괴하여 단백질 혼합물을 얻었고, IMAC(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)를 통해 니켈 이온과 히스티딘의 결합을 이용하여 목표 단백질을 정제했다. Ultrafiltratio...2025.12.19
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재결합 단백질의 발현/ Expression of recombinant proteins in E. coli2025.01.121. GST-tagged Proteins glutathione S-transferase (GST), histidine (HIS), 기타 친화성 태그를 이용하여 단백질을 정제하게 되면 기존에 잘 알려진 생화학적 특성을 가진 단백질과 알려지지 않은 생화학적 특성을 가진 재조합 단백질의 N 말단에 결합하여 정제를 도와준다. GST 단백질은 번역 시에 안정적이고 가용성이 높은 단백질로 빠르게 접히기 때문에, GST 태그를 포함하면 태그가 없을 때보다 더 잘 발현하고 용해도를 촉진하는 경우가 많다. 2. BCA assay BCA는 Lowry...2025.01.12
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