6XHis-tagged eGFP 발현, 정제 및 특성 분석

문서 내 토픽

1. Green Fluorescent Protein (GFP) 및 enhanced GFP (eGFP)

GFP는 해파리 Aequorea Victoria에서 발견된 단백질로 238개의 아미노산으로 이루어져 있으며 27kDa의 크기를 가진다. eGFP는 GFP의 64번 아미노산인 Phenylalanine을 Leucine으로, 65번 아미노산인 Serine을 Threonine으로 변형한 형태로, 더욱 강한 형광을 나타낸다. eGFP는 488nm에서 excitation하고 509nm에서 emission하며, 26.9kDa의 monomer 크기를 가진다. eGFP는 육안으로 식별 가능하여 reporter gene으로 사용되거나 유전자의 전사 및 발현 정도를 확인하는 데 활용된다.
2. Protein Tagging 및 6xHis-tag를 이용한 단백질 정제

Protein tagging은 목표 단백질을 encoding하는 재조합 유전자 양 끝에 tag sequence를 삽입하여 peptide 또는 짧은 단백질이 함께 발현되도록 하는 방법이다. 6xHis-tag는 6개의 Histidine을 C-terminus 또는 N-terminus에 융합시키는 방식으로, 변성상태에서도 정제가 가능하고 크기가 작아 단백질에 영향을 적게 준다는 장점이 있다. pET28a(+) vector를 통해 eGFP를 과발현할 때 IPTG inducer에 의해 조절되며, 숙주 미생물은 E.coli BL21(DE3) strain이 사용된다.
3. 단백질 정제 기술: Sonication, IMAC, Ultrafiltration

Sonication은 10~20kHz의 초음파로 세포 또는 세포 내 구조체를 파괴하여 과발현된 목표 단백질을 포함한 cell protein mixture를 얻는 방법이다. Immobilized metal ion affinity chromatography (IMAC)는 6xHis-tagged 단백질이 금속이온이 있는 resin에 선택적으로 부착되는 원리를 이용하며, imidazole을 포함한 elution buffer로 목표 단백질을 순수하게 정제한다. Ultrafiltration은 Molecular weight cut-off (MWCO)를 기준으로 분자를 분리하는 방법으로, 본 실험에서는 10K MWCO를 사용하여 eGFP를 정제한다.
4. 단백질 정량 방법: Extinction Coefficient Assay 및 Lowry Assay

Extinction coefficient assay는 특정 단백질이 280nm 이외의 파장에서도 absorption peak를 가지는 특성을 이용하며, Lambert-Beer 법칙(A=εcl)을 활용하여 농도를 계산한다. eGFP는 488nm에서 absorption peak를 가지므로 280nm와 488nm에서의 농도 비율을 통해 functional eGFP의 양을 구할 수 있다. Lowry assay는 Biuret method를 변형한 방법으로, 알칼리성 용액에서 단백질의 peptide bond와 copper가 complex를 형성하고, Folin-Ciocalteu reagent와 반응하여 진한 청색을 띄는 원리를 이용한다. 본 실험에서 Extinction coefficient assay 결과는 0.298mM, Lowry assay 결과는 0.353mM으로 차이가 발생했으며, 이는 Lowry assay가 시료 내 amino acid 조성에 영향을 받기 때문이다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

1. Green Fluorescent Protein (GFP) 및 enhanced GFP (eGFP)

GFP는 생명과학 연구에 혁명을 가져온 획기적인 도구입니다. 자연적으로 형광을 발생시키는 능력으로 인해 세포 내 단백질 위치 추적과 실시간 생물학적 과정 모니터링이 가능해졌습니다. eGFP는 원래 GFP의 한계를 극복하여 더 밝은 형광, 빠른 성숙 시간, 그리고 향상된 안정성을 제공합니다. 이러한 개선사항들은 형광 현미경, 유세포 분석, 그리고 생체 영상 분야에서 연구의 정확성과 효율성을 크게 증대시켰습니다. 다양한 색상의 형광 단백질 개발로 멀티플렉싱 실험도 가능해져 현대 생명과학 연구의 필수 요소가 되었습니다.
2. Protein Tagging 및 6xHis-tag를 이용한 단백질 정제

단백질 태깅 기술은 재조합 단백질 연구에서 매우 효율적인 방법입니다. 6xHis-tag는 특히 니켈 친화성 크로마토그래피를 통한 빠르고 효과적인 정제를 가능하게 합니다. 이 방법은 상대적으로 저렴하고 간단하며, 높은 특이성으로 인해 오염 물질을 최소화할 수 있습니다. 다만 태그가 단백질의 기능이나 구조에 영향을 미칠 수 있다는 점을 고려해야 하며, 필요시 TEV 프로테아제 등으로 태그를 제거해야 합니다. 전반적으로 단백질 정제의 시간과 비용을 절감하면서도 높은 순도를 달성할 수 있는 실용적인 기술입니다.
3. 단백질 정제 기술: Sonication, IMAC, Ultrafiltration

이 세 가지 기술은 단백질 정제 과정의 서로 다른 단계에서 중요한 역할을 합니다. Sonication은 세포 용해의 효율적인 방법으로 물리적 에너지를 이용하여 세포막을 파괴합니다. IMAC는 높은 특이성으로 목표 단백질을 선택적으로 정제하는 강력한 도구입니다. Ultrafiltration은 분자량 기반 분리로 완충액 교환과 농축을 동시에 수행할 수 있습니다. 이들을 조합하면 높은 순도와 수율의 단백질을 얻을 수 있으며, 각 기술의 장단점을 이해하고 적절히 선택하는 것이 효율적인 정제의 핵심입니다.
4. 단백질 정량 방법: Extinction Coefficient Assay 및 Lowry Assay

단백질 정량은 생화학 연구에서 필수적인 기술입니다. Extinction Coefficient Assay는 자외선 흡수를 이용한 빠르고 비파괴적인 방법으로, 특히 순수한 단백질 샘플에 적합합니다. 반면 Lowry Assay는 더 민감하고 다양한 단백질에 적용 가능하지만, 시간이 더 소요되고 간섭 물질의 영향을 받을 수 있습니다. 두 방법 모두 장단점이 있으므로, 샘플의 특성과 연구 목적에 따라 선택해야 합니다. 정확한 정량은 후속 실험의 신뢰성을 보장하므로 신중한 방법 선택과 적절한 표준물질 사용이 중요합니다.