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리포트 / 자연과학

6주차_plasmid DNA miniprep

"6주차_plasmid DNA miniprep"에 대한 내용입니다.
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최초등록일 2023.08.31 최종저작일 2023.05
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6주차_plasmid DNA miniprep
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    목차

    I. Purpose

    II. Theory
    1. Plasmid DNA
    2. Plasmid DNA extraction
    3. Alkaline lysis method (Resuspension, Lysis, Neutralization)
    4. Purification of plasmid DNA

    III. Apparatus/reagent

    IV. Procedure
    1. Plamid DNA Miniprep
    2. Agarose Gel Electrophoresis
    3. Nucleogen Plasmid Mini Kit Protocol

    V. Data&Results

    VI. Discussion

    본문내용

    Purpose: Alkaline lysis method를 이용해 E.coli로부터 plasmid DNA를 추출한다.

    Theory
    1. Plasmid DNA
    bacteria에는 genomic DNA와 plasmid DNA가 존재한다. 그 중 plasmid DNA는 extrachromosomal DNA로, genomic DNA와 달리 자체 적으로 복제 가능한 복제기점을 갖는다. 또한, genomic DNA와 달리 plasmid DNA는 생존에 필 수적이지 않은 정보를 갖고 있다. 예를 들어, Plasmid DNA에는 antibiotic resistance gene과 같 은 selective marker가 존재한다. 이를 이용하면 antibiotic이 포함된 plate로 cell-selection을 해서 유전자 발현 여부를 조사할 수 있다. 따라서, plasmid DNA transformation에 성공한 cell만을 선택적으로 배양, 회수하면 plasmid를 성공적 으로 획득할 수 있다. Plasmid DNA는 super coiled DNA이므로 유전자 분리, 조작, cloning과 같 은 유전 공학에 쉽게 활용될 수 있다. 또한, pH 변화에 따른 DNA 구조 변화가 genomic DNA 보다 적고 복원이 쉽기 때문에 쉽게 분리, 조작할 수 있다는 장점을 갖는다.

    2. Plasmid DNA extraction
    Plasmid DNA를 활용하기 위해서는 준비과정으로써 extraction이 필요하다. 이러한 과정을 prep이라고 하며, plasmid DNA의 추출양에 따라서 mini, midi, maxi prep으로 나눌 수 있다. Mini prep은 20μg까지 추출할 때, midi prep은 50-100μg을 추출할 때 사용되며, maxi prep은 최대 1mg을 추출할 때 사용한다. bacteria에 존재하는 Genomic DNA로부터 plasmid DNA를 선택적으로 분리할 때, 크기와 모양 차이를 이용한다.

    참고자료

    · Jeremy M.Berg, Biochemistry, 8th, W. H. Freeman, 2015, pp613-620
    · B. Alberts, Molecular Biology of the Cell, 6th , Garland Science, 2014, pp1021-1030

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    • 1. Plasmid DNA
      Plasmid DNA is a circular, double-stranded DNA molecule that exists independently of the chromosomal DNA in bacterial cells. Plasmids are widely used in molecular biology and genetic engineering as they can be easily manipulated and replicated within host cells. They serve as important tools for gene cloning, protein expression, and DNA sequencing. Plasmids often carry genes that confer antibiotic resistance, allowing for the selection of transformed cells. The study of plasmid DNA has been crucial in advancing our understanding of genetic mechanisms and enabling the development of various biotechnological applications.
    • 2. Plasmid DNA extraction
      Plasmid DNA extraction is a fundamental technique in molecular biology that allows for the isolation and purification of plasmid DNA from bacterial cells. This process typically involves cell lysis, separation of plasmid DNA from chromosomal DNA, and subsequent purification steps. Efficient plasmid DNA extraction is crucial for downstream applications such as gene cloning, DNA sequencing, and genetic engineering. Various methods have been developed, including alkaline lysis, column-based purification, and magnetic bead-based separation, each with its own advantages and limitations. The choice of extraction method depends on factors such as the desired purity, yield, and intended use of the plasmid DNA. Continuous advancements in plasmid DNA extraction techniques have improved the reliability, speed, and scalability of this essential procedure.
    • 3. Alkaline lysis method
      The alkaline lysis method is a widely used technique for the extraction and purification of plasmid DNA from bacterial cells. This method relies on the differential denaturation of chromosomal DNA and plasmid DNA under alkaline conditions. The process involves the lysis of bacterial cells using a solution containing sodium hydroxide and sodium dodecyl sulfate (SDS), which disrupts the cell membrane and denatures the chromosomal DNA. The plasmid DNA, being more compact and supercoiled, remains relatively intact. Subsequent neutralization with an acidic solution, such as potassium acetate, allows for the renaturation of plasmid DNA while the denatured chromosomal DNA and cellular debris precipitate. The plasmid DNA can then be separated and purified through further steps, such as centrifugation and ethanol precipitation. The alkaline lysis method is known for its simplicity, cost-effectiveness, and ability to yield high-quality plasmid DNA, making it a widely adopted technique in molecular biology laboratories.
    • 4. Plasmid DNA purification
      Plasmid DNA purification is a crucial step in many molecular biology and genetic engineering applications, as it ensures the isolation of high-quality, contaminant-free plasmid DNA. After the initial extraction, various purification methods are employed to remove impurities such as genomic DNA, RNA, proteins, and endotoxins. Common purification techniques include column-based chromatography, where the plasmid DNA is selectively bound to a solid support and eluted, and density gradient centrifugation, which separates the plasmid DNA based on its buoyant density. Additionally, magnetic bead-based purification and anion-exchange resins have become popular due to their scalability and automation potential. The choice of purification method depends on factors such as the desired purity, yield, and downstream applications of the plasmid DNA. Effective plasmid DNA purification is essential for ensuring the reliability and reproducibility of experiments involving recombinant DNA technology, gene expression, and genetic manipulation.
    • 5. Agarose gel electrophoresis
      Agarose gel electrophoresis is a widely used analytical technique in molecular biology for the separation and visualization of DNA molecules based on their size and charge. In this method, DNA samples are loaded into wells in an agarose gel matrix and subjected to an electric field, causing the negatively charged DNA molecules to migrate through the gel. Smaller DNA fragments move faster through the porous agarose matrix, while larger fragments migrate more slowly. This separation allows for the identification and analysis of different DNA species, such as linear, circular, and supercoiled plasmid DNA, as well as the determination of DNA fragment sizes. Agarose gel electrophoresis is an essential tool for various applications, including DNA cloning, restriction fragment analysis, and the verification of plasmid DNA integrity and purity. The technique is relatively simple, cost-effective, and provides valuable insights into the molecular characteristics of DNA samples, making it a fundamental method in molecular biology laboratories.

  • 자료후기

      Ai 리뷰
      이 문서는 plasmid DNA의 특성과 추출 방법인 alkaline lysis method에 대해 매우 상세하고 체계적으로 설명하고 있으며, 실험 과정과 결과를 잘 정리하여 제시하고 있다.

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