[분자생물학] DNA클로닝 결과레포트

소개

기본자료입니다...

목차

<실험과정>
1. PCR
2. 전기영동
3. Elution (DNA분리)
4. DNA ligation
5. Transformation (형질전환)
6. culture
7. Plasmid DNA분리
8. 전기영동
9. 제한 효소 (절단)
10. 전기영동(확인)

본문내용

<1> PCR의 원리

; 다음 과정을 계속 반복하여 진행하면서(보통 25∼35회)원하는 DNA부분을 증폭시키는 것이 PCR의 원리이다.
다시 말하면 튜브에 재료를 집어넣고 뜨겁게 덥혔다 식혔다 하면(이건 기계가 알아서 해 준다.) Taq polymerase 가 알아서 유전자를 합성해주는 것입니다.

1>. DNA 의 변성 (denaturation)
; 90°C - 96°C로 가열하여 double strand DNA(ds DNA)를 single strand DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 ssDNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA polymerase도 온도가 아주 높은 상태에서는 활성이 낮아질 수 있으므로 보통 94°C로 한다. 첫 cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다.

2>. Primer 의 결합 (annealing)
; 50°C - 65°C에서 진행됩니다. 염기간의 결합은 G와 C는 세군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 사실 primer 를 만드는 것도 이 annealing temperature를 고려하여 합성해야 한다. 일반적으로 GC content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다.

3>. DNA의 합성 (polymerization)
; 70°C - 74°C에서 시행하며 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000-4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle 에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋겠다.

참고자료

· 없음