[분자생물학실험] Real–Time PCR

소개

Real–Time PCR에 관한 분자생물학실험레포트입니다.

목차

1. 실험 목적
2. 실험 이론 및 원리
3. 실험 방법
4. 실험 결과
5. 참고 문헌

본문내용

1. 실험 목적
1.1. real-time PCR의 기본원리를 이해하고, 직접 real-time PCR을 수행하여, DNA를 많은 양으로 증폭시킨다.

2. 실험 이론 및 원리
2.1. DNA polymerase (DNA 중합 효소)
PCR의 반응은 DNA 중합효소에 연관되어 있으며 좋은 효소를 선택하는 것이 좋은 결과를 얻기 위해서 중요하다. 낮은 온도에서 나타나는 Taq DNA 중합효소의 활성이 PCR 반응의 특이성에 영향을 미치는 원인 중 하나다. 이러한 경우 primer는 DNA에 비특이적으로 결합하게 되며 비특이적인 산물을 만들어내게 된다. 이러한 문제를 최소화하기 위해서 “hot-start” 기능을 가진 효소를 사용해야 하는데 이 효소는 낮은 온도에서나 초기 DNA denature 과정에서의 Taq의 활성을 억제하게 되어 이러한 비특이적인 산물을 만들어내는 것을 방지해주는 역할을 한다.

2.2. Reverse transcriptase (역전사 효소)
역전사 효소는 qRT-PCR의 성공에서 DNA 중합효소와 마찬가지로 중요한 요소이다. 이러한 역전사 효소를 어떠한 것을 선택하냐에 따라 온전한 cDNA의 합성 수율이 높아지며 또한 높은 온도에서도 좋은 활성을 유지하게 된다. 높은 온도는 실험에서 RNA의 2차 구조를 파괴하여 RNA를 cDNA에 만드는데 도움을 주는 중요한 역할을 하게 된다.

2.3. Real-time PCR
Real time PCR법은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 해석하는 기술이다. End Point에서 PCR 증폭산물을 확인하는 기존의 PCR법에 비해서 다음과 같은 잇점을 갖고 있다.

① DNA와 RNA의 정확한 정량이 가능하다.
② 전기영동이 필요 없어 신속하고 간편하게 해석할 수 있으며, 오염의 위험성이 적다. 현재는 유전자 발현해석과 SNP typing 등에 있어 필수적인 기술이 되고 있다.

참고자료

· T.A. Brown, 『유전자 클로닝 입문』 제 4판, 이병무 외 4명 역, 월드사이언스, 2004, p.6～11, p.33～35, p.68～70.