[분자생물학실험]RNA Isolation and analysis

최초 등록일
2018.09.26
최종 저작일
2018.09
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소개글

세포에서 RNA를 추출하기 위해서 RNA를 RT–PCR 하여 cDNA 상태로 만들고 cDNA를 PCR 하여 sample을 loading 하고 band를 확인해보는 실험레포트입니다.

목차

1. 실험 목적

2. 실험 이론 및 원리
가. RNA 추출 원리
나. RT-PCR
다. PCR
라. 이 외의 시약을 첨가하는 이유

3. 실험 방법
가. 실험 과정

4. 실험 결과
가. 결과 분석

5. 토의 사항
가. 실험 고찰

본문내용

1. 실험 목적
가. 세포에서 RNA를 추출하기 위해서 RNA를 RT?PCR 하여 cDNA 상태로 만들고 cDNA를 PCR 하여 sample을 loading 하고 band를 확인하기 위함이다.

2. 실험 이론 및 원리
가. RNA 추출 원리
포유세포는 보통 한 세포 당 10-5㎖ RNA를 포함하고 있으며 이 중 80∼85%가 rRNA, 15∼20% 가 tRNA, 1∼5%가 mRNA로 이루어져 있다. 리보솜 RNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가 지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심 분리 및 크로마토그래피에 의해 순수하게 분리할 수 있는 반면, mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵세포 mRNA는 3말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA나 tRNA 등으로부터 분리해 낼 수 있다.
RNA를 추출할 때 가장 주의해야 할 점은 핵산 가수분해효소에 의해 분해되지 않고 완전하게 얻는 것이며, 또한 단백질이 제거된 순수한 RNA를 얻는 것이다. 모든 세포에 존재하는 ribonuclease의 작용으로부터 RNA를 보호하기 위해서는 RNA 추출 시 사용되는 모든 기구와 시약에 ribonuclease의 오염이 없어야 한다. heparin이나 RNAin은 ri bonuclease의 강력한 저해제로써 분리되지 않는 RNA를 얻는데 매우 유용하다.
RNA는 세포내에서 단백질과 결합되어 있으며 그들 간의 친화력은 매우 강하고 단백질을 얼마나 제거하느냐가 RNA의 순도를 결정하게 된다. 단백질을 제거하기 위해 페놀추출, proteinase k에 의한 단백질의 분해 및 강력한 denaturant인 gvanidinium을 이용한 추출방법과 이들 간의 조합 등 여러 가지 방법에 의한 RNA를 추출한다.
순수하고 완전한 RNA를 분리하는 것은 유전자를 클로닝하고 유전자 발현을 분석하는데 대단히 중요하다.

참고 자료

Gene Cloning & DNA Analysis An Introduction 7th Ed. by T A Brown by alive.

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