PCR 반응 및 PCR Product확인(전기영동)

목차

1. 실험 목적
2. 서론
3. 실험 준비물
4. 실험 방법
5. 결과
6. 토의

본문내용

PCR 의 원리는 단순하고, 쉽게 응용할 수 있기 때문에 순수 분자생물학 분야 이외에도 의학, 이학, 농학, 수의학, 식품과학, 환경과학 뿐만 아니라 고고학이나 인류학에 이르는 다양한 이르는 다양한 분야에서 그 활용범위를 넓혀가고 있다. PCR은 (1)DNA 의 변성 (denaturation), (2) Primer 의 annealing, (3) 신장반응(extension) 세 가지 반응단계가 반복적 연쇄반응(cycle)이 일어난다.
(1) DNA 의 변성 (denaturation) : 일반적으로 두가닥 DNA 를 94~95°C 에서 15~30 초간 처리하여 각각 한 가닥 DNA 로 분리시킨다. 너무 온도를 높이거나 처리시간을 지나치게 늘리면 내열성 DNA polymerase 라 해도 활성을 잃게 되므로 주의가 필요하다.
(2) Primer 의 annealing : 열처리로 한가 닥으로 변성한 DNA와 primer를 공존시킨 후
온도를 낮추면 2종류의 primer는 가각 상보적인 한 가닥 주형 DNA에 annealing한다. Annealing에 가장 적합한 온도와 시간은 primer의 염기배열과 그 길이에 따라 결정되지만 일반적으로 55°C에서 30~1분간 annealing을 한다.
(3) 신장반응(Extension) : 4 종류의 기질 (dNTP)이 공존하는 상태에서, DNA polymerase를 작용시켜 primer를 신장시킨다. 신장반응에 필요한 시간은 주형 DNA의 농도, 증폭단편의 크기, 반응온도에 따라 좌우되지만 일반적으로는 Thermus aquaticus (Taq) polymerase를 사용할 경우 72°C에서 30초~10분간 (1kbp/min)처리한다.
(4) Cycle 수 : PCR의 경우 n회의 cycle로 표적배열은 2n 배가 되지만 실제로는 이보다 낮다. 효율이 저해되는 이유는 DNA polymerase의 실활 및 증폭단편 (주형DNA)의 증가로 인한 효소분자/주형비의 부족, 증폭단편간의 annealing 되는 속도가 빨라져서 primer의 anneal과 경합, phosphate 축적으로 인한 효소반응 저해 등이 일어난다.

참고자료

· 스마트 생명과학 ㈜라이프사이언스
· 분자생물학 ㈜라이프사이언스
· 일반생물학 ㈜라이프사이언스