A+ 생화학 실험 결과레포트, DNA재조합, 형질전환, 전기영동

소개글

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목차

1. 실험제목

2. 목적 및 원리
1) PCR
2) 핵산 전기영동(DNA electrophoresis)
3) 재조합 유전자 형질전환
4) 활성균주의 선발과 선택배지의 이용
5) 활성클론의 플라즈미드 분석

3. 재료 및 방법
1) 실험 재료
2) 실험 방법

4. 결과

5. 고찰
1) PCR, 핵산 전기영동(DNA electrophoresis)
2) Transformation
3) 플라즈미드 분리 및 분석

본문내용

실험제목
'PCR 클로닝 및 활성 형질전환주 분석’

목적 및 원리
EST13L 유전자를 증폭한 후 T-easy vector에 연결하여 대장균에 열 충격 법으로 형질전환하고 배지에 배양한 후 활성균주를 선발하고 분석한다.
● PCR
PCR법은 DNA 또는 RNA의 특정 영역을 시험관 내에 증폭하는 기술이다. 이론적으로 한 가닥의 DNA만 있어도 여러 가닥으로 증폭시킬 수 있다. 원리가 단순하고 쉽게 응용할 수 있기 때문에 다양한 분야에 활용되고 있다. PCR은 통상적으로 DNA변성, Primer의 Annealing, 신장반응의 세 단계로 진행된다. 먼저 DNA변성은 DNA를 94도에서 15-30초 간 처리하여 두 가닥으로 분리시킨다. 그리고 열처리한 DNA에 DNA프라이머를 결합시키는데 일반적으로 50-55도에서 30초-1 분간 Annealing 한다.(primer annealing) 이 때 온도를 높일수록 프라이머와 주형 DNA의 mismatch가 감소하여 반응 특이성이 높아진다. 마지막으로 신장반응에서는 4 종류의 dNTP(dATP, dTTP, dGTP, dCTP)가 존재하는 상태에서 DNA polymerase를 이용하여 72도에서 DNA를 합성한다. 여기서 내열성 DNA polymerase를 사용하고 이 실험에서는 taq polymerase를 사용한다. 일반적으로 이 세 과정을 30회 반복한다. 이론적으로 30회의 CYCLE로 표적배열은 2^30 배가 되지만 실제로는 그보다 낮다. 그 이유로는 주형 DNA의 증폭으로 인한 효소 부족, 주형 DNA간의 Annealing, phosphate 축적으로 인한 효소반응 저해가 있다. PCR반응을 진행할 때 반응액의 Mg2+, dNTP농도가 중요한데 1.5~2.5 mM의 MG2+농도가 필요하고 MG2+농도에 따른 적절한 DNTP농도가 요구된다. MG2+농도는 pcr에서 효소활성, primer annealing, 합성된 DNA의 정확도, primer-dimer의 형성에 영향을 미치며 dntp농도가 낮을수록 mismatch와 mispriming 현상을 감소시킨다.

참고 자료

레닌저 생화학, 강의자료