재조합 DNA를 이용한 T4 ligase의 발현

소개

재조합 DNA를 E.coli에 transformation시켜 T4 ligase를 발현시키고 enzyme activity test를 한 실험보고서입니다. 한 학기 동안의 모든 실험을 포함하고 있습니다.

목차

없음

본문내용

2010 Fall Semester Biochemistry Experiment
T4 DNA ligase expression using recombinant DNA transformation, purification and enzyme activity test of T4 DNA ligase
T4 DNA ligase는 bacteriophage T4에서 발현되는 DNA ligase이다. T4 DNA ligase는 nick이 생긴 DNA 또는 linear form인 두 종류의 DNA를 phosphodiester 결합으로 이어주는 DNA ligation 기능을 한다. 나란히 배열된 5‘ phosphate와 3’ OH 사이에 phosphdiester 결합을 형성해주며 sticky end를 가지는 DNA뿐만 아니라 blunt end를 가지는 DNA 또한 결합시킬 수 있다. 또한 cofactor로 ATP를 필요로 하는 것이 특징이다.
한 학기 동안의 연구를 통해 T4 DNA ligase gene (insert gene)을 pET-21a(+)Mal-TEV vector와 재조합하여 recombinant vector를 만들고 E. coli Rosetta2 (DE3) pLysS strain에 transformation 했다. 이 transform된 세포들에 IPTG를 처리하여 우리가 원하는 protein인 T4 DNA ligase를 induction하고 protein harvest과정을 거쳐 T4 DNA ligase를 대량으로 얻어내었다. chromatography과정을 통하여 T4 DNA ligase외의 다른 물질들을 제거하여 정제하였다. enzyme activity test를 통해 T4 DNA ligase가 성공적으로 얻어졌으며 ligase activity도 가지고 있음을 확인할 수 있었다.

참고자료

· 1. Tomkinson, A.E., Vijayakumar, S., Pascal, J.M. & Ellenberger, T. (2006) Chem. Rev. 106, 687–699.
· 2. El Omari, K., Ren, J., Bird, L.E., Bona, M.K., Klarman, G., Legrice, S.F. & Stammers, D.K. (2006) J. Biol. Chem. 281, 1573–1579.
· 3. Nandakumar, J. & Shuman, S. (2005) J. Biol. Chem. 280, 23484–23489.