[생명공학실험 예비레포트]Ligation

소개글

"[생명공학실험 예비레포트]Ligation"에 대한 내용입니다.

목차

1. 실험 제목

2. 실험 목적

3. 실험 이론
1) Ligation
2) DNA ligase (리가아제)
3) 인산다이에스터 결합 (Phosphodiester bond)
4) DNA 운반체(Vector)
5) T-vector를 이용한 PCR product의 cloning

4. 기구 및 시약
1) 기구
2) 시약
3) 사전 준비

5. 실험 방법

6. 참고 사항
1) 예상 결과
2) Buffer(완충액)
3) 제한효소(restriction enzyme)
4) VECTOR의 조건
5) Insert DNA : Vector = 3 : 1로 하는 이유
6) pGEM-T Easy Vector
7) Ligation에 영향을 미치는 요인
8) DNA Ligation step 추가
9) cloning

본문내용

3) 실험 목적
- 이전 실험에서 증폭된 PCR product를 T-vector에 삽입한다.
- Ligation에 관련된 화학 반응을 이해하고 T-vector와 PCR product의 ligation 원리를 이해한다.

4) 실험 이론
∎ Ligation
- DNA나 RNA의 끝을 이어주는 과정을 가리키는 용어이다. DNA 복제 과정에서 새로 합성된 5′-PO₃(Phosphate group)와 인접해 있는 새로운 DNA 조각의 3′-OH(하이드 록시기) 간의 phosphodiester bond (인산다이에스터결합) 을 형성하여 두 DNA 파편을 연결하는 과정이다. 이 반응에 이용되는 효소는 ligase라 하며 DNA를 기질로 사용하는 ligase를 DNA ligase, RNA를 기질로 사용하는 ligase를 RNA ligase라 한다. RNA ligase는 단일가닥의 DNA 또는 RNA끼리 연결해 주는 효소로 5‘-RACE와 같은 특수한 목적의 실험에서 사용될 수 있다. 유전자 재조합 과정에 사용되는 ligase는 주로 DNA ligase에 의해 진행되고 cofactor(보조인자) ATP가 DNA의 Sugar-phosphate (당-인산) 골격을 연결하는데 필요한 에너지로 사용된다. ligation이 되면 세포는 연결된 하나의 분자로 인식되며 정상 세포의 DNA의 일부분처럼 복제되고 발현된다.

DNA Ligation은 일련의 과정을 거쳐 진행된다.
1. DNA ligase는 조효소(ATP or NAD+)와 반응하여 자체 Adenylation 된다.
2. Adenyl group은 5‘phosphate 말단으로 옮겨진다.
3. phosphate bond의 형성은 인접한 3'OH와 Adenylation된 말단의 반응을 통해 진행되며, 이로 인해 AMP-DNA결합이 공격을 받게 되고 AMP가 떨어져나간다.

참고 자료

없음