단백질 정량법 비교: BCA와 Bradford 방법

문서 내 토픽

1. BCA Assay (Bicinchoninic Acid)

단백질이 구리 이온을 1가 양이온으로 환원시키는 성질을 이용한 정량법이다. 환원된 구리 이온은 BCA 분자 2개와 반응하여 보랏빛 착물을 형성하며, 562nm 파장에서 흡광도를 측정한다. 장점은 버퍼 물질 간섭이 적고, 높은 온도에서 민감하고 빠른 반응을 하며, 계면활성제와 함께 사용 가능하고 반응 시약이 안정적이다. 단점은 실온에서 다량의 단백질 정량 시 반응이 완전하지 않을 수 있고, 농축된 샘플은 희석이 필요하며, 단백질 성질이 변할 수 있다.
2. Bradford Assay

Coomassie brilliant blue dye가 단백질과 결합하면 최대 흡광 파장이 465nm에서 595nm로 변하는 성질을 이용한다. Bradford solution은 Coomassie blue G250, phosphoric acid, methanol의 혼합물로 구성되며, 반응은 2분 내에 완결되고 발색은 1시간까지 안정하다. 장점은 방법이 간단하고 반응이 신속하며 감도가 높아 1μg까지 정량 가능하다. 단점은 SDS 등 계면활성제의 영향을 받기 쉽고, 산성 반응액으로 인해 지질 함유 샘플에서 침전이 생길 수 있으며, 희석 후 재실험이 어렵고 단백질이 비가역적으로 변성된다.
3. Lowry Assay

BCA와 유사한 방법으로 감도를 개량하여 만들어졌다. pH 10 부근에서 Folin-Ciocalteu reagent가 Protein-complex에 의해 환원되어 650~750nm에서 빛을 강하게 흡수하며, 산화된 aromatic protein residue에 의해 청람색으로 변한다. 장점은 BCA보다 감도가 높고 정확도와 정밀도가 높다. 단점은 준비 과정과 시약이 복잡하고, 반응속도가 느려 시간이 오래 걸리며, 넓은 샘플 그룹에서는 유용하지 않고 pH에 민감하다.
4. 흡광도 측정 원리

Beer-Lambert 법칙에 따르면 흡광도는 흡광계수, 길이, 농도에 비례한다. 단백질 정량에서 흡광도는 방향족 고리를 가지는 Phe, Tyr, Trp에서 최대 흡수 파장이 280nm로 나타난다. DNA 정량에서는 260nm에서 최대 흡수를 보인다. 발색 시약이 없어도 정량이 가능하고 빠르고 간단하며 단백질 변성이 없다. 그러나 버퍼, pH, 염 등의 영향을 받고 아미노산 조성에 따라 측정값이 영향을 받는다.

Easy AI와 토픽 톺아보기

1. BCA Assay (Bicinchoninic Acid)

BCA assay는 단백질 정량에 있어 매우 실용적이고 신뢰할 수 있는 방법입니다. 이 방법은 Cu2+ 이온이 단백질의 펩타이드 결합에 의해 Cu+로 환원되고, 생성된 Cu+가 BCA와 복합체를 형성하여 562nm에서 강한 흡광도를 나타내는 원리를 이용합니다. BCA assay의 장점은 넓은 선형 범위(20-2000 μg/mL), 높은 감도, 그리고 많은 화학물질에 대한 우수한 내성입니다. 특히 환원제나 킬레이트제의 존재에도 비교적 영향을 적게 받아 복잡한 샘플 분석에 유리합니다. 다만 반응 시간이 다소 길고 온도에 민감할 수 있다는 점은 고려해야 합니다.
2. Bradford Assay

Bradford assay는 단백질 정량의 가장 빠르고 간편한 방법 중 하나입니다. Coomassie Brilliant Blue G-250 염료가 단백질의 소수성 아미노산과 상호작용하여 색상 변화를 일으키는 원리로, 실온에서 단 2-5분 내에 결과를 얻을 수 있습니다. 이 방법은 빠른 처리 속도와 낮은 비용이 주요 장점입니다. 그러나 선형 범위가 상대적으로 좁고(1-10 mg/mL), 계면활성제나 특정 화학물질에 민감하며, 단백질의 조성에 따라 편차가 발생할 수 있다는 제한점이 있습니다. 따라서 신속한 스크리닝에는 적합하지만 정밀한 정량에는 다른 방법과 병행하는 것이 좋습니다.
3. Lowry Assay

Lowry assay는 역사적으로 가장 널리 사용되어온 단백질 정량 방법으로, 높은 감도와 우수한 정확성을 제공합니다. 이 방법은 Folin-Ciocalteu 시약이 단백질의 방향족 아미노산(특히 타이로신과 트립토판)과 반응하여 색상 변화를 일으키는 원리입니다. Lowry assay의 주요 장점은 매우 낮은 단백질 농도(10-1000 μg/mL)도 감지할 수 있는 높은 감도와 좋은 정확성입니다. 그러나 반응 시간이 길고, 많은 화학물질(환원제, 계면활성제, 금속 이온 등)에 의해 간섭을 받으며, 절차가 복잡하다는 단점이 있습니다. 현대에는 더 편리한 방법들이 개발되어 사용 빈도가 감소했습니다.
4. 흡광도 측정 원리

흡광도 측정은 분광광도법의 기본 원리로, 물질이 특정 파장의 빛을 흡수하는 정도를 측정하는 방법입니다. Beer-Lambert 법칙(A = εbc)에 따르면, 흡광도는 물질의 몰 흡광 계수(ε), 용액의 경로 길이(b), 그리고 물질의 농도(c)에 비례합니다. 이 원리는 단백질 정량뿐만 아니라 다양한 생화학 분석에 광범위하게 적용됩니다. 흡광도 측정의 장점은 비파괴적이고, 빠르며, 정량적 결과를 제공한다는 점입니다. 그러나 측정 정확도는 분광광도계의 성능, 큐벳의 투명도, 샘플의 탁도 등 여러 요인에 영향을 받으므로, 정확한 측정을 위해서는 적절한 대조군 설정과 기기 보정이 필수적입니다.

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