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쥐 해부 보고서 평가B괜찮아요

1. 호흡계1) Larynx공기의 흐름과 연하된 음식물의 흐름이 교차하는 점에 위치한다. 기도의 보호, 발성, 호흡 작용, 흉곽의 고정 등의 기능이 있다.① 기도의 보호: 연하 ·구토 때에는 음식물이 침입하지 못하도록 닫힌다. 이물질이 후두점막을 자극하면 해수반사(咳嗽反射)가 일어난다.② 발성: 성문(聲門)이 닫히고, 호기류에 의하여 성대가 진동하면 후두원음이 생긴다. 성대의 긴장, 진동부분의 폭 ·길이, 호기압의 크기에 의하여 음의 고저나 강약이 생긴다.③ 호흡작용: 안정호흡 때에도 성문은 호기 때에 좁아지고, 흡기 때는 다소 넓어진다.④ 흉곽의 고정: 후두가 닫히면 흉곽이 고정되고, 또 숨을 모아 복압을 걸 수도 있다.2) Lungs좌측 폐와 우측 폐는 식도, 심낭 내 심장, 주요 상행 및 하행 혈관, 림프관, 신경, 그리고 기관의 하부 끝을 포함하는 느슨한 연결조직으로 이루어진 격막인 종격동(mediastinum)에 의해 정중선에서 나누어진 분리된 흉막강 안에 들어있다. 내벽이 호흡상피로 이루어진 폐포에서 가스교환이 일어난다. 쥐의 폐는 우폐 3엽, 좌폐 2엽으로 나뉴어져 있다. 폐의 표면을 덮고 있는 흉막은 폐흉막이라 하여 폐문 주위에서 벽측흉막으로 이행하는데 이 양자 사이에는 좁은 틈이 있고, 흉막액으로 채워져 있다. 이것에 의해서 폐의 수축운동 때 흉벽과의 마찰을 방지한다.2. 소화계1) Esophagus식도는 신축성 있는 근육질의 관이며, 위로 음식이 통과할 수 있게 한다. 층상 편평상피로 덮여있다.2) Stomach위는 최근에 섭취된 음식물을 받아들이는 근육질의 방으로서 소화효소와 점액으로 된 윤활제를 분비한다. 본격적으로 소화가 시작되는 기관이다. 위의 내벽세포에서는 펩시노겐과 염산을 분비한다. 염산은 강한 산으로 음식물에 섞여있는 세균과 미생물을 없애준다. 또한 염산에 의해 펩시노겐이 활성화되어 펩신을 만들어 단백질을 분해하는 소화가 일어난다. 그러나 이렇게 강한 산과 소화효소를 분비하는 위는 영향을 받지 않는데, 그 이유는 위의 내벽에서 뮤신이 분비되어 위를 보호하기 때문이다.3) Small intestine위액에 의해 암죽처럼 된 음식물은 소장을 통과하는 사이에 소장벽에서 분비되는 장액, 간에서 만들어지는 쓸개즙, 이자에서 나오는 이자액 등과 혼합된다. 소장은 소화운동을 하면서 영양분을 소화·흡수하는 중요한 부분이다. 소장은 위에서부터 duodenum, jejunum, ileum의 세 부분으로 구분한다.4) Large intestine대장은 cecum, colon, rectum으로 구분한다. 맹장 내의 내용물은 장시간 정류하여 인접하는 근위결장(近位結腸) 사이를 왕복하면서 그 사이에 내장미생물의 발효 및 소화 작용을 받는다. 맹장에 이어지는 결장은 상행결장, 횡행결장, 하행결장, S상결장 등으로 구분된다. 직장은 거의 천골의 전면 정중선을 내려가 항문이 된다. 대장 점막에는 소장과는 달리 융모가 없다. 점액을 분비하는 배세포는 대장의 아랫부분으로 갈수록 많아지는 것은 내용물의 수송을 용이하게 하기 위한 것이다.5) Liver간은 우엽이 좌엽보다 4∼5배 크며, 대부분이 몸 정중선의 오른쪽에 있고 왼쪽에도 퍼져 있는 최대의 선장기(腺臟器)이다. 빛깔은 암적갈색을 띠며, 구조는 물렁물렁하고 부서지기 쉬우므로 압박이나 손상을 받기 쉽다. 중앙부 아랫면의 간문에는 수 개의 관이 모여 있다. 즉, 간에 혈액을 보내는 간동맥도 그 하나로서, 이것은 간의 활동을 유지한다. 위 ·장 ·지라로부터의 정맥혈을 간으로 보내는 것이 문맥이다. 문맥혈은 소화관으로 흡수한 영양물질을 간으로 보내고, 간에서는 여분의 당류를 글리코겐 형태로 저장한다. 간으로부터의 정맥혈은 간정맥으로 되어 하대정맥으로 흘러 들어간다. 간이 분비한 쓸개즙은 한 군데로 모아져서 간문의 수담관에서 쓸개로 흘러 들어간다.6) Pancreas십이지장과 비장 사이에 수평으로 가로지르는 선(線)으로, 그 중앙을 췌관이 통하고 있으며, 십이지장의 유두부에 개구한다. 이자액을 분비하는 gland system 사이에는 섬 모양의 특수한 조직인 랑게르한스섬이 존재한다. α세포는 아닐린에 의해 붉게 염색되는 과립이 있어서 글루카곤을 분비하며, β세포는 아닐린에 의해 청자색으로 염색되는 과립을 함유하여 인슐린을 분비한다. 따라서 이자는 이자액을 분비하는 외분비선인 동시에 당대사 호르몬의 내분비선이기도 하다.3. 순환계1) Heart혈액을 순환시키는 원동력이 되는 순환계의 중추기관으로, 주기적인 수축과 이완을 되풀이함으로써 혈액을 온몸에 공급하는 펌프역할을 한다. 우심은 온몸을 돌고 온 정맥피가 들어와서 폐로 보내지는 곳이고, 좌심은 폐로부터 산소가 많은 신선한 동맥피가 들어와서 온몸으로 보내지는 곳이다.2) Lymphatic system림프관과 림프절로 이루어지며 림프를 순환시키고 있다. 조직세포 간극에 있는 림프관은 모세림프관이라 하며, 한 층의 내피세포로 되는 가는 관으로, 점차 굵은 림프관에 집중하여 도중에서 적어도 1개의 림프절을 지나 여기서 생성되는 림프구를 받아들여 흉관 또는 우림프총관을 거쳐 쇄골하정맥으로 들어간다. 따라서 림프는 다시 혈장에 되돌아간다. 림프관의 벽은 근층(筋層)이 없고 내부에 역류를 방지하는 판막이 있으므로 림프의 흐름은 정맥 혈액과 같이 수동적으로 행해진다.4. 비뇨계1) Kidneys신장의 단면을 보면 세 부분으로 구성되어 있는데, 바깥쪽은 피질이고, 그 안쪽은 수질, 그리고 수질안쪽이 신우이다. 신장의 피질은 혈관이 많이 분포되어 있으므로 암적갈색으로 보이며 이곳에는 사구체와 보먼주머니로 구성된 말피기소체가 있고 둥글고 잔 알갱이 모양으로 보인다. 담홍색을 띠고 있는 수질은 세뇨관과 이들이 합쳐 놓은 집합관으로 구성되어 있으며 집합관의 끝이 신우에 열려 있다. 그리고 신우는 수뇨관으로 이어져 있다. 신장은 노폐물과 불필요하게 많은 수분, 그리고 무기염류를 오줌으로 만들어 내보내므로 혈액 내의 이온의 농도와 pH, 그리고 혈압을 조절한다. 또한 비타민D를 활성화시켜서 소장에서 칼슘이 흡수되도록 도와주며 여러 가지 호르몬의 합성에도 관여한다.2) Urinary bladder비뇨기관 중에서 근육질의 확장부분이다. 형상 ·크기 ·벽의 두께는 그 안에 있는 요량의 증감에 따라 변하는데, 요의 양이 적거나 그 안이 비었을 때에는 납작한 구형으로 위에 많은 주름을 볼 수 있고, 요가 가득 차면 점막이 늘어나서 고르고 매끄러운 계란형으로 된다.내요도구 주위에 방광괄약근이 있다. 보통 때에는 이 근육이 수축되었다가 요가 괴면서 방광벽이 늘어나는데, 배뇨시에는 이 근육이 늘어나면서 방광벽의 민무늬근이 수축하고 동시에 복벽의 가로무늬근도 수축해서 복압을 높여 주므로 배뇨가 되도록 한다.5. 생식계-Female1) Ovary난소는 일차적인 기능으로 자성 생식체(난자)와 호르몬인 에스트로겐과 프로게스테론을 생산하는 상대적으로 밀도가 높은 난형의 구조이다. 황체 또한 옥시토신, 릴랙신, 인히빈, 액티빈을 생산한다.2) Oviduct난관은 누두부, 팽대부, 협부로 구성된다. 누두부는 난관의 제일 끝(두부 혹은 난소의 끝)이고 깔때기 모양 입구로 구성된다. 이런 열린 깔때기 모양 입구는 새롭게 배란된 난자를 “잡아채는” 주머니를 형성한다. 난관의 평활근육층(근층)의 일차적인 기능은 새로 배란된 난자와 정자를 수정장소(팽대부)로 수송하는 것이다. 난관에 의한 생식체의 수송은 정자와 난자가 팽대부에서 서로 만나게 하기 위해 그것들이 서로 반대방향으로 움직일 것을 요구한다. 난관의 점막은 미수정난자가 자유로이 움직이게 하는 최적의 환경을 제공하는데 필요한 물질들을 분비한다. 그것은 또한 배란 후 난자에 도달할 때까지 정자의 기능을 유지시킨다.3) Uterus자궁은 난관을 자궁경부와 연결한다. 설치류의 자궁은 중복자궁이다. 자궁의 주요한 기능은 정자 수송, 황체융해와 주기성의 조절, 착상 전 태아의 환경, 태반으로의 모체 기여, 태아와 태반의 배출 등이다.4) Cervix자궁경부는 윤활, 분출체계, 임신 중 방어를 제공한다. 임신 기간 동안 자궁경부는 외부환경으로부터 자궁내 수태물을 고립(차단)시키는 역할을 한다. 프로게스테론의 영향 하에 점액은 더욱 끈끈해진다.5) Vagina질의 주요 기능은 성교기관으로서의 역할뿐만 아니라 방뇨 시 소변의 배출구의 역할도 담당한다. 또한 그것은 분만 시의 수동적인 출산구이기도 하다. 질은 불완전하게 조직되고 정확히 정의되지 않은 근육층과 잘 발달되고 적응된 점막상피세포를 가진다.-Male1) Testes정소는 정자의 제조·조립 공장으로서 역할을 하며 무한한 잠재력을 지닌 산물인 정자를 만든다. 정소는 정자와 안드로겐의 일종인 테스토스테론을 생산하기 때문에 수컷의 주요한 생식기관으로 간주된다. 게다가 정소는 인히빈과 에스트로겐 그리고 정자의 기능에 중요한 것으로 추정되는 여러 단백질을 생산한다. 이것들은 또한 세정관(seminiferius tubules)으로부터 일차적으로 유래되는 액체를 생성한다. 이 액체는 정자가 유동적이며 정소에서 이동할 수 있도록 하는 운반체의 역할을 한다. 정소에서 생성되어지는 이 액체(종종 망상액(rete fluid)이라 불림)는 또한 세르톨리 세포(Sertoli cells)에서 합성되는 산물을 포함한다.

농/수산학| 2006.12.05| 4페이지| 1,000원| 조회(1,614)

쥐, 역할, 해부, 명칭, 각기관

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우유의 응고반응

우유와 요구르트가 만났을 때!!2005년 5월 4일2003-128671. casein이란?건락소(乾酪素)라고도 한다. 유즙(乳汁)의 주성분이며, 우유의 카세인에 대해서 가장 잘 연구되어 있다. 사람이나 양의 카세인도 비슷한 성질을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 카세인은 우유 속에 약 3% 함유되어 있으면서 우유에 함유된 전단백질의 약 80%를 차지한다. 우유에 산을 가해서 pH 4.6으로 하면 등전점에 도달하여 침전하므로, 쉽게 조제(調製)할 수 있다. 송아지의 위액에 함유된 효소인 레닌을 우유에 가하면 응고하는데, 이것은 카세인이 효소의 작용을 받아 변화하기 때문이다. 이 응고는 우유가 위 속에서 소화효소의 작용을 충분히 받을 수 있도록 장시간 머물 수 있게 해준다. 우유를 레닌으로 응고시킨 것을 레네카세인이라고 하며, 여기에 발효나 그 밖의 가공을 한 것이 치즈이다. 또, 단백질화학의 연구 대상으로도 19세기부터 흥미를 가지게 되었다. 즉, 카세인이 균일한 단백질이 아니라여러 종류의 단백질이 혼합된 혼합물이라는 것은 옛날부터 알려져 있었다.2.우유의 응고 방법우유를 응고시키는 방법에는 크게 산, 열, 레닛(rennet) 응고법이 있다.①산 응고법산을 이용하여 응고를 촉진시키는 방법으로 프레쉬 치즈나 크림 치즈를 만들 때 사용한다. 우유는 산과 만나면 응고된다. 우유의 단백질의 80%가 카세인이라는 성분이기 때문이다. 그런데 이 카제인이라는 단백질은 열보다 산에 의해 응고되는 단백질이다.②열 응고법열처리는 단백질의 변성을 초래한다. 즉 이것은 단백질의 화학적 형태의 일부가변화되었다는 뜻이다. 그러나 그 중 단백질의 주요 골격인 단백질간의 연결부위는끊어진 것이 아니다. 이러한 변성은 약 80℃에서부터 시작되고 그 일부는 가역적이다. 우유의 가장 많은 단백질의 성분인 카제인은 비교적 열에 안정적이다. 또열에 의한 응고는 125℃로 60분을 가열할때 일어난다.우유를 가열할 때 표면장력이 저하되면 표면에 존재하는 단백질분자 중 락트알부민(lactal-bumin)과 락토글로부린(lactoglobulin)이 막의 형태로 모이고 또 지방구끼리 서로 밀착되어 응고됨으로써 피막이 형성된다. 피막의 성분으로는 단백질이 3~4%, 지질이 약 3%, ~4% 함유되어 있다.③rennin 응고법대부분의 치즈는 주로 송아지의 네번째 위에서 얻어지는 효소제인 레닛을 첨가하여 응고를 촉진시키는 레닛 응고법을 사용한다. 레닛에는 레닌(rennin)이나 펩신(pepsin) 같은 단백질 분해효소를 다량 함유되어 있어 우유를 응고시키는 역할을 하게 된다. 즉 우유 단백질인 카제인 분자가 서로 덩어리를 만들면서 우유가 부드러운 젤리 같은 형태로 변하는 것이다.레닛을 이용하여 우유를 응고시킬 때에는 우유의 온도가 중요한데15℃ 이하일 때에는 응고가 일어나지 않으며, 60℃ 이상이 되면 열에 의해 레닌이 불활성화된다. 적절한 온도는 20℃-40℃ 사이로, 프레쉬 치즈나 크림치즈 같은 소프트 치즈를 만들 때에는 비교적 낮은 온도에서, 체다 치즈나 에멘탈 같은 하드치즈는 이보다 높은 온도에서 응고시킨다. 이렇게 치즈의 종류마다 온도가 다른 이유는 응고기간 동안의 온도에 따라 커드가 생성되는 속도나 단단한 정도, 탄력성 등의 성질이 달라지기 때문이다. 응고에 걸리는 시간은 치즈 종류에 따라 30분에서 36시간 사이로 차이가 많이 난다.3.우유는 응고가 안 되는데 요구르트를 넣으면 응고가 되는 이유?우유의 단백질은 80%가 카세인인데 이것은 열보다는 산에 의해 응고가 잘된다. 물론 열을 가했을 때 피막정도는 생길 수 있다. 그러나 치즈 같은 덩어리는 생기지 않는다. 그런데 요구르트를 부으면 요구르트 안에 있는 젖산에 의해 카세인이 응고반응을 일으키는 것이다. 우유를 오랫동안 놓아두면 자체 내에서 젖산이 형성되어 덩어리가 생기는데 이것 또한 산에 의해 응고가 되는 것이라 할 수 있다.4.치즈란?치즈를 만드는 원료. 전지유, 탈지유, 크림, 버터밀크 등의 원료유를 유산균에 의해 발효시키고 rennet 등의 응유효소를 가하여 응고시킨 후 유청(whey)을 제거한 다음 가열 또는 가압 등의 처리에 의해서 만들어진 신선한 응고물 또는 숙성시킨 식품을 말한다. 가공 치즈는 이렇게 만들어진 자연 치즈에 유제품을 혼합하고 첨가물을 가하여 유화한 것을 말한다.5.치즈의 제조법① 응고(coagulation):우유류를 레닛 효소나 젖산균에 의하여 굳어지게 한다.② 배수(drainage):젖산균이 생성하는 산에 의하여, 또는 가열에 의하여 응고된 우유를 가늘게 절단하고 점차적으로 수축시키면서 수분을 제거한다.③ 성형(moulding):수축된 응유를 판에 채워 압착하고 배수시키면서 예비발효를 계속시킨다.④ 숙성(ripening):일정한 온도를 유지하는 장소에 수주일∼수개월, 종류에 따라서는 1년 이상을 두어 발효미생물의 작용에 의하여 특유한 풍미와 조직을 가지게 한다.이와 같은 4단계의 조건을 여러 가지로 배합하여 서로 다른 종류의 특징을 가지는 치즈를 만든다. 숙성이란 발효와 같은 말인데 이 기간 중에 젖당은 젖산으로 변화되어 치즈 내부를 산성으로 만들고, 젖산균이나 다른 미생물에서 분비되는 여러 가지 효소에 의하여 단백질은 펩티드를 거쳐 아미노산으로 분해되어 맛있는 성분의 주체가 된다.

자연과학| 2005.05.12| 3페이지| 1,000원| 조회(2,516)

우유, 치즈, 응고, 카세인, casein

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pcr의 원리와 종류 평가C아쉬워요

PCR 원리와 종류PCR(polymer chain reaction)은 DNA의 원하는 부분을 증폭하는 방법이다. DNA molecule의 어느 부분이든지 그 border sequence만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 denaturation, annealing, extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 PCR을 구성하고 있는 요소들에는 DNA template, primer, dNTP, polymerase등이 있으며, PCR 과정에서 그것의 sensitivity와 accuracy에 가장 영향을 미치는 것은 primer와 temperature이다.1. PCR의 각 과정(a) DenaturationPCR의 가장 첫 단계이며, 온도가 높아짐에 따라 DNA의 염기 사이에 있는 수소결합이 끊어져 두가닥의 DNA가 분리된다. 일반적으로 94℃ 정도에서 1분간 진행된다.(b) Annealing각각 두가닥으로 분리된 DNA molecule에 primer가 붙는 과정이다. Primer는 그들과 상보적인 염기를 가지고 있는 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 accuracy를 결정짓는 단계이며, 어느 온도로 진행되는 가는 primer의 길이와 그것을 이루고 있는 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 primer가 DNA molecule에 잘 달라붙지 않아 그 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮을 경우에는 primer가 mismatch할 확률이 높아서 정확도가 그만큼 더 떨어진다. 일반적으로 온도는 아래의 식에서 결정되며, 여기서 trial & error 과정을 포함하여 좀 더 구체적으로 결정한다.Tm = (4*[G+C]) + (2*[A+T])℃여기서 G+C의 계수가 더 큰 이유는 그들이 A+T의 수소결합 보다 센 수소결합을 하기 때문이다.(c) ExtensionPrimer로부터 DNA가 뻗어나가는 과정이다. 물론 template와 상보적 결합으로 인하여hybridizing할 때의 시간이 많이 걸려, 그 효율이 떨어진다. 일반적으로 17-30mer가 primer의 크기로 적당하다.? 프라이머 농도 : 프라이머 농도는 반응초기에 주형 DNA의 107 배 정 도이다. 프라이머는 30회의 반응이 지난 후에도 1～5% 정도만이 소모되고 그대로 남는다. 과다하게 많을 경우에는 프라이머 이량체(dimer)의 형성 및 잘못된 염기쌍 형성으로 인한 비특이 산물이 생성된다.2) polymerasePCR에서 사용하는 polymerase는 Taq1 polymerase로 이것은 Themus aquaticus로부터 추출한 효소이다. 이 생명체는 바다 밑의 뜨거운 곳에서 사는데, 이 때문에 이 생물의 효소는 열에 저항성이 있다. 따라서 Taq1 polymerase 역시 열에 저항성이 높다. 이러한 성질이 PCR에서 이 polymerase를 쓰는 이유이다. 보통 PCR을 할 경우, denaturation 과정에서 온도가 94℃까지 올라가며, 대부분의 단백질은 이 온도에서 변성이 되어 그 기능을 상실한다. 하지만 Taq1 polymerase는 열에 저항성이 높기 때문에 이 온도에서도 변성이 되지 않는다.? Tag DNA polymerase : 열에 높은 안정성. 최적 pH는 8.2～9.0. 최 적 온도는74℃. 최소량은 25μl 당 0.5unit3)주형 DNA : 길이가 완전해야 한다초기의 주형 DNA가 너무 많으면 불완전하게 합성된 사슬의 수가 너무 많아지게 되어 전기영동시 끌림현상을 유발.주형 DNA수가 너무 적으면 증폭산물내에 정확하지 않게 복제 된 사슬이 많아진다4)dNTP농도 : 일반적으로 200μM dNTP를 사용한다 반응이 완료 될 때 열에 의해서 약 50% 가 파괴된다. 최종 template의 약 10,000배 정도의 분자비율이 유지되도록 초기 농도를 결정한다.4가지 뉴클레오티드가 모두 같은 농도로 존재해야 한다.5)반응 완충용액 (Reaction buffer): 대부분의 PCR 반응은 10～50mM Tris-HCl 완충용eer 사 등에서 합성(염기서열 5'-NNNNNNNNN-3'으로 주문)하여 사용한다. 50~250 ng을 이용하면 되는데, 대개 100 ng/ml로 희석해 놓고 1 ml 씩 반응에 이용한다. 사용 전 25°C 또는 상온에 10분 두었다가 쓴다.2. 70°C에 10분 두었다가 곧바로 얼음에 옮긴다. 간단히 원심분리하여 바닥에 시료를 모으고 다음과 같은 시약을 첨가한다.5x first strand buffer 4 ml0.1 M DTT 2 ml10 mM-each dNTP 1 mlSuperscriptTM II (200 units/ml) 1 mlu 이 과정은 첫번째 가닥의 cDNA를 만드는 역전사 과정으로 reverse transcriptase(RT)를 요한다. 이 효소는 AMV-RT, MMTV-RT 등이 있는데, superscript II는 cDNA의 합성을 보다 효율적으로 할 수 있고 RNase가 오염되지 않은 RT로 Gibco 사에서 구입할 수 있다.3. 42°C에서 50~60분 반응시키고 70°C에서 15분 두어 효소를 불활성화 시킨다. 대부분의 경우 이 반응물을 2~10 ml template로 하여 직접 PCR 반응에 이용할 수 있다. 그러나 PCR 하고자 하는 gene의 크기가 1 kb 이상인 경우에는 다음 과정을 첨가하는 것이 좋다.4. E. coli RNase H(2 units/ml) 1 ml를 첨가하고 37°C에서 20분 반응시킨 후 phenol/chloroform extraction 또는 QIAquick column 등을 이용하여 purification한다.5. 과정 3 또는 과정 4의 반응물을 template로 하여 PCR 반응을 시행한다.2) SSCP(Single Strand Conformation Polymorphism)어떤 입자들의 전기장 내에서의 이동속도는 그 입자의 크기와 형태에 영향을 받는다. Single strand DNA는 non-denaturing 조건하에서 분자내의 상호작용에 의하여 2차 구조를 형성하게 되는데 이 2차 구조는 DN 이러한 문제를 해결하고자, 1988년 Frohmann 등은 다음과 같은 방법을 소개하고, 이를 RACE(rapid amplification of cDNA ends)라 이름하였다. 즉, cDNA의 일부 염기서열을 알고 있으면, 이 부분에서 gene specific primer를 합성하고 PCR reaction을 통해 5' 혹은 3'-end 까지의 DNA를 증폭하는 것이다. 3'-RACE에서는 mRNA의 3'-end에 존재하는 poly(A) tail을 이용할 수 있으므로, down stream primer로 oligo-(dT) primer를 쓴다. 그러나, 5'-RACE의 경우는 gene specific primer로 합성한 1st single strand cDNA의 끝에 TdT(terminal deoxynucleotidyl transferase)를 사용하여 poly(A) 혹은 poly(C) tail을 인위적으로 만들어 주어야만 한다.4) ISPCR(In Situ Polymerase Chain Reaction)PCR은 원하는 DNA를 대량으로 증폭시키는 방법이고, in situ hybidization (ISH)은 세포나 조직에 존재하는 극미량의 DNA 및 RNA를 찾아낼 수 있음은 물론 원하는 유전자들의 위치까지 확인할 수 있는 방법이다. ISPCR은 이 두 가지 방법의 장점을 혼합하여 응용한 방법으로서 PCR의 sensitivity와 ISH의 specificity를 고루 갖추고 있다. ISPCR의 실험원리는 일반적인 PCR 방법과 같으나, slide glass 등의 사용에 적합한 ISPCR용 기구가 필요하며 사용하는 기구에 따라 반응시키는 방법들이 다양하게 제시되어 있다.ISPCR은 세포내의 target sequence를 증폭시키는 것으로부터 반응이 시작되며 세포막을 통해 여러 물질(예: PCR 용액에 들어 있는 salt 등)들이 쉽게 이동할 수 있도록 세포막을 HCl, proteinase K 또는 Triton X-100 등으로 처리해 주는 과정을 거쳐야 한다로 발현되는 유전자인지를 보는 것으로 subtractive hybridization보다 방법이 훨씬 간단한 것이 장점이지만, 실험의 sensitivity와 specificity가 낮은 것이 단점이다. 최근 이 방법에 대한 연구가 많이 진행되면서 새로운 더 좋은 방법들이 계속 발표되고 있으므로 최신 논문을 참고로 적절한 조건을 찾아내어 실험을 시행하면 좋은 결과를 얻을 수 있을 것으로 기대된다.6) Hot start PCRTaq1 polymerase는 37℃에서도 그 활성이 좋기 때문에 간혹 가다가 첫 번째 denaturation 과정이 완전히 진행되기도 전에 primer가 DNA molecule에 붙어서 extension이 일어나는 경우가 있다. 이렇게 낮은 온도에서 annealing이 일어날 경우 primer가 mismatch할 확률이 높고, 따라서 결과적으로 정확도가 떨어지는 band를 얻게 된다. 이것을 막는 방법이 Hot-start PCR를 이용하는 것이다. Hotstart PCR에서는 primer가 정확하게 원하는 DNA site에만 붙을 수 있도록 충분한 온도가 된 후에 PCR이 일어나도록 필요한 물질(ex. polymerase, MgCl2, dNTP)을 넣어준다. (물론 그 전에는 안 넣어준다는 말이다.) 이렇게 하면 위에서 말한 것과 같은 mismatch를 피할 수 있어, 상대적으로 clear한 band를 얻을 수 있다.7) RAPD PCRRAPD (random amplified polymorphic DNA) PCR은 일반적으로 두 생명체가 계통 유전학적으로 얼마나 유사성이 있는가를 판별할 때 사용한다. PCR할 때 primer가 짧을 경우 genome 상에 여러 군데 달라 붙어서 여러 fragment를 만든다. 이렇게 해서 생겨난 여러 fragment를 전기영동을 사용해서 확인하면 생명체마다 각각 독특한 band를 형성하는데 이것을 가지고 생명체간의 유사성을 판별할 수 있다. 만약 두 생명체가 비슷한 종일 경우에는 band의 모양이 비슷할 것이여졌다.

자연과학| 2005.05.12| 11페이지| 1,000원| 조회(3,335)

PCR, primer, polymer chain reacti

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플라스미드 dna 분리

plasmid DNA분리1. 실험일자:2003.3.25.2. 실험 목적:plasmid DNA를 정제하는 방법을 익히고 정제해 본다.3. 실험기구 및 시약solution1,2,3. 100%ethanol, 70%ethanol.원심분리기. voltexter, 피펫, ice box4. 실험의 원리기본적인 원리는 세균의 cell wall과 cell membrane을 부수고 DNA 만을 분리하는 것이다. 이 때 중요한 것은 세균이 원래 가지고 있는 chromosomal DNA와 plasmid DNA를 구분하여 분리하는 것이다. 이 둘은 모두 DNA이므로 성질이 비슷하기 때문에 구분하여 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 chromosomal DNA는 크기가 상당히 커서 가장 큰 플라스미드의 길이는 E. coli 의 염색체 길이에 8%밖에 되지 않는다. 이러한 물리적 차이에 의하여 분리를 할 수 있다. 또한 플라스미드와 bacteria DNA의 구조의 차이에 의해 분리된다. 플라스미드와 염색체는 구형인데 염색체는 extract 시 구형에서 선형조각으로 깨어지며 플라스미드에는 구형으로써 변화가 없다. 이 구조적인 차이점을 이용하여 정제된 플라스미드를 얻을 수 있다.5. 실험과정 및 설명①키운 균주를 1.5ml 따서 원심분리 시키고 상층액만 취한다.?원래는 진공상태를 이용(aspirate off)해서 상층액을 뽑지만 오늘은 피펫을 이용하였다.②solution1을 vortexing.?세포벽을 깨는 과정이다.EDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 하고 이때 sucrose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 는 역할을 한다. 그 후 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 된다. 따라서 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨어야 한다.③solution2를 넣고 몇 회 inversion 한다.?이때 SDS는 ionic detergent로 세포막을 녹여 안에 있던 세포 내용물이 용액으로 흘러나오고 이때 alkali 용액인 NaOH에 노출되어 DNA가 denaturation된다. 이것은 pH변화에 따라서 non-supercoiled DNA는 denaturation되지만 supercoiled DNA는 안정한 성질을 이용한 것이다. solution2를 넣고 inversion하면 액체가 점성을 가지게 되는데 DNA가 denatufation되어 생긴 결과라고 생각된다.④solution3을 넣고 얼음에 10분동안 incubate.?산성인 sodium acetate를 넣으면 pH를 급격히 7.0까지 복구시키면 크기가 작고 supercoiled form을 유지하고 있던 plasmid는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 된다. 그래서 solution3을 놓고 흐늘자 하얗게 영키는 것이 관찰되었다.

자연과학| 2005.05.12| 2페이지| 1,000원| 조회(2,646)

플라스미드, DNA, plasmid

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Agarose gel 전기영동법 평가A+최고예요

1.실험일자 ; 2005. 3. 182.실험목적 : Agarose gel 전기영동법의 원리를 이해하고 DNA를 직접 전기영동 시켜본다.3.실험기구 및 시약 : agarose, 1X TAE , EtBr, comb, 전기영동 장치, UV light box4.실험방법① agarose와 1x TAE를 500㎖ 플라스크에 넣은 후 전자렌지에 2-4분간가열하여 agarose를 완전히 녹인다.② 약 60℃까지 식힌 후 EtBr를 25㎕ 첨가하여 섞어 plated에 부은후 comb를 꼽아 20-30 분간 굳힌다.③ comb를 제거하고 전기 영동 장치에 1 x TAE를 넣은 후 gel을 넣는다.④ 시료에 loading buffer를 첨가하여 gel의 well 에 loading한다.⑤ 전기를 걸어준뒤 30~60분 기다린다⑥ DNA가 내려오면 UV light box 위에서 확인한다.5.결과 및 토론실험결과 DNA가 전기영동에 의하여 끌려 내려온 것을 볼 수 있었다. 같은 조원의 것과 비교해 볼때 같은 양과 같은 모양을 보여 실험이 올바르게 되었다고 생각된다. loading buffer를 피펫을 이용하여 섞어 주는데 이것은 DNA가 움직이는 것을 눈으로 확인 할수 있게 하고 DNA가 가라앉을 수 있도록 하기위하여 넣는 것이다.전기영동의 원리를 간단히 살펴보면 Agarose gel에 DNA와 loading dye를 넣고 전기를 걸어주면 DNA는 인산기 때문에 음전하를 띠므로 매질을 타고 양전하 방향으로 움직이게 된다. 이때 움직이는 속도는 DNA의 크기, 모양에 따라 다르므로 매질 내에서 종류에 따라 분리하게 되며 전기영동은 DNA의 크기, 분리, 양의 확인이 가능하다.☆이동속도에 영향을 주는 요인들1) DNA 분자의 크기가 클수록 느리게 이동한다.2) Agarose의 농도가 높을수록 느리게 이동한다.3) DNA 형태(구조)에 따라 이동속도가 다르다. 일반적으로 supercoiled DNA가 가장 빨리, 그다음 linear DNA, open circular DNA의 순으로 빠르게 이동한다.?agarose gel에 있는 작은 pore를 통과할 때, linear DNA가 가장 저항을 많이 받기 때문에 linear DNA의 이동 속도가 가장 느리다. 다음은 circular DNA이고,가장 빨리 이동하는 것은 똘똘 뭉쳐져 있어서 저항을 가장 적게 받는 supercoiled plasmid 이다.4) 부하되는 전압이 높을수록 이동속도가 빠르다.?낮은 전압에서 선형으로 된 DNA 조각의 이동속도는 부하되는 전압에 비례한다. 그러나 전기장에서 전류의 흐름이 커짐에 따라 높은 분자량을 가진 DNA 조각의 이동속도는 빨라지게 되므로 전압이 올라감에 따라 agarose gel에서 DNA 분리 효과가 감소된다. 2 kb보다 큰 DNA 조각들의 분리를 최대로 하기 위해서는 agarose gel에 5 V/cm 이상의 전압을 부하시켜서는 안 된다.5) 전기장의 방향도 이동속도에 영향을 미친다.6) Ethidium bromide는 DNA 이동속도를 15% 정도 감소시킨다.7) 전기영동 완충용액의 성분과 이온강도도 전기영동 속도에 영향을 준다.?전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도 또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을 주기 때문이다.☆시약들의 특징 및 역할①DNA loading dye아가로즈의 well에 DNA를 넣어줄때 DNA용액을 무겁게 하여 아가로즈의 홈으로 가라앉하는 역할을 하며 그 성분에 전기영동되는 속도가 다른 두개의 염색시약이 들어 있어 DNA와 같이 전기영동되며 DNA의 전기영동된 정도를 알 수 있게 하는 역할을 한다.②전기영동 bufferTAE (Tris acetate EDTA) : DNA 분자량이 큰 경우, agarose electrophorsis에서 쓴다.TBE (Tris borate EDTA) : DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰인다.③EtBrEthidium bromide의 약자이며 얇은 판 모양으로 생겼는데 이 판 모양이 DNA의 nucleotide사이사이에 끼어들게 된다. 즉 당과 염기가 있는데 그 사이에 끼어드는 것이다.

자연과학| 2005.05.12| 3페이지| 1,000원| 조회(2,948)

DNA, 전기영동, Agarose gel

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