Superoxide dismutase (SOD) 기기분석Reference-1Steen V et al (2003) ; PNAS (vol.100;24:13875-13880) The dual nature of human extracellular superoxide dismutase: One sequence and two structuresIntroduction■ Superoxide dismutase (SOD)는 크게 3가지 SOD-1, SOD-3, SOD-2로 나눌 수 있다 ■ SOD-1와 SOD-3는 Cu/Zn을 포함하고 있으며, 각각 cytosol과 extra cellular에 존재하고 SOD-2는 Mn을 포함하며 mitochondrial에 존재한다 ■ 포유류 동물에서는 Cu/Zn 을 포함하는 Superoxide dismutase 효소 두 isoform이 존재한다 ■ Cu/Zn-SOD는 intracellular space와 extracellular matrix에서 찾을 수 있다 ■ 두 효소 모두 superoxide 음이온을 hydrogen peroxide로 dismutate 시키므로써 항산화 역할을 한다Methods and Results■ Separation of Monomeric and Dimeric EC-SOD Sample : EC-SOD purified from Human aorta 1) 100ug purified EC-SOD in Tris-HCl and NaCl 2) Acidified by Trifluoroacetic acid (TFA) 3) Aquapore RP-300 C8 reversed-phase HPLC column (2.1mm x 220mm;Brownlee lab) 4) Eluted by segmented linear gradient Solvent B (90% acetonitrile/0.08% TFA) in Solvent A (0.1%TFA)[기기조건] Column operated Temp. at 23℃ Flow rate of 200ul/mim Detected at 220 and 280nm[결과] Lane 2,5 (=fraction1), Lane3,6(=fraction2) 으로 western blot확인결과 HPLC에 의해 분리됨을 확인 할 수 있음■ Alkylation and Separation of EC-SOD MonomersMethods and ResultsEC-SOD fraction 1,2를 동결건조 30mM Hepes,pH8.3 + 5M guanidinium hydrochloride+25mM IAA에 녹인다 23℃에서 30분간 반응시킨다 4) Trifluoroacetic acid (TFA)을 이용하여 산성화시킨다 5) HPLC로 분석한다Reference-2Free Radical Biology Medicine (20010); ELINA G et al.Biologycal aging does not lead to the accumulation of oxidezed Cu, Zn-superoxide dismuats in the liver of F344 Rats.Introduction■ 생물학적 노화가 진행됨에 따라 세포내 superoxide와 hydrogen peroxide의 생성이 증가 ■ 항산화효소의 활성이 나이와 상관성이 있게 변화하며 그중에서도 superoxide dismutase (SOD) 가 중요한 항산화 효소로 볼 수 있다 ■ SOD는 다음과 같이 세가지 isoforms 으로 구성되어 있다 1) cytosolic - Cu/Zn-SOD (SOD1) 2) mitochondrial - Mn-SOD (SOD2) 3) extracellular - Cu/Zn-SOD (SOD3) ■ Cu/Zn-SOD의 중요성 - Shorter longevity 그룹에서는 Cu/Zn-SOD값이 정상에 비해 감소 - Enhanced longevity 그룹에서는 Cu/Zn-SOD값이 정상에 비해 증가 : 대부분의 연구에서 동일한 결론, SOD 는 age-dependent 함Methods and Results■ RP-HPLC analysis and purification of Cu,Zn-SOD Sample : Rat liver, Bovine erythrocyteRP-HPLC (Varian 9012) – Vydac C4 column (250 x 4.6mm. Equipped with a 10 x 4.6mm guard column) Equilibrated : 0.1% aqueous TFA (mobile phase A) Eluted : 1ml/min Gradient : 0.9%/min acetonitrile rinse final, 54% acetonitrile in 0.1% aqueous TFA Detection : absorbance 215nmPeak 1 : rat liver Cu,Zn-SOD Peak 2 : Bovine erythrocyte Cu,Zn-SODReference-3Anal. Chem. 2010, 82, 2287-2394; Y.Nuevo O et alQuantitiative Analysis and Simultaneous Activity Measurements of Cu, Zn-Superoxide Dismutase in Red Blood Cells by HPLC-ICPMSIntroduction■ Antioxidant enzymes : SOD, CAT, GPx ■ Cu,Zn-SOD is cytosolic metalloenzyme of about 32kDa ■ Catalyze the dismutation of the superoxide anion radical into hydrogen peroxidase ■ Cu,Zn-SOD as a major target of oxidative damage in Alzheimer's Disease (AD) and Parkinson's disease (PD) – specific biomarker of important health disorders such as ALS, AD and PD Purpose ■ 항산화효소의 절대적인 정량측정에 있어 개선을 통해 정확하고 정밀한 분석방법으로의 발전을 위함 ■ 보통의 Cu,Zn-SOD측정은 효소자체와 superoxide scavenger 사이의 competition을 사용한 indirect way 방법을 통한 enzyme activity를 확인하므로써 측정하는 방식이었음Methods and Results■ Sample treatment Sample : erythrocyte (red blood cells) 1) centrifugation at 3,000g for 10min, 4℃ (separated from plasma) 2) hemolysed : ice-cold DW (4.5ml / 0.5ml of cells) 3) Shaking for 3min (using vortex) 4) hemoglobin precipitation : ethanol/chloroform = 2:1 added 5) Shaking for 5min 6) Centrifuged (10,000g, 4℃, 1h) 7) HPLCMethods and ResultsReference-4Chemico-Biological Interactions 116(1998) 1-17; Jose R.P et al.Incubation of superoxide dismutase with malondialdehyde and 4-hydroxy-2-nonenal forms new active isoforms and adductsIntroduction1 2 3 4 5 6Methods and Results■ Cu,Zn-SOD : Method (Mugil sp.) total 40g liver를 사용, CM-sepharose chromatography를 이용하며 0.1mM EDTA가 포함된 50mM sodium phosphate buffer로 투석 ■ Mn-SOD : Method (Crapo et al) total 40g liver를 사용하여 0.1mM EDTA가 포함된 50mM K-phosphate buffer, pH7.8를 이용하여 분쇄 1) 15,000g에서 30분간 원심분리하여 얻은 상층액을 65℃, 5분간 식힌다 2) 12,000g에서 15분간 원심분리 후 얻어진 상층액을 얻음 3) (NH4)SO4를 더해 30min간 섞어준다 (stirring) 4) 원심분리하여 침전물을 모두 제거한 후에 (NH4)2SO4를 이용하여 다시 30분간 섞어준다 (stirring) 5) 12,000g에서 15분간 원심 후 상층액은 버리고 침전물에 0.1mM EDTA가 포함된 10mM Tris-HCl buffer, pH8.0 10ml을 넣고 녹인다 6) Q-Sepharose fast flow column (7 x 2cm) 에 loading시킨 후 linear NaCl gadient (0-250mM) elution 한다.Purification of Cu,Zn- and Mn-SODMethods and Results7) 8) 9) 10){nameOfApplication=Show}
Glutathione peroxidase (GPx) 기기분석201007_한미화 작성Reference-1Distribution of Selenium-Containing Proteins in Human SerumYuxi Gao et al; Biological trace element research 2004Introduction- Selenium is and essential trace element for animals and humans.- 80% of body selenium was found to be protein bound.- selnium-containing proteins or subunits in tissues of mammals have been reported, glutathione peroxidase (GPx), selenoprotein P, albumin, type-1 iodothyronine 5'-deiodinase.- Selenium distribution among albumin, selenoprotein P and plasma-GPx, in human plasma or human serum was investingated by high-performance liquid chromatography (HPLC) coupled with a fluorescence detector (FLD)- 21±1 kDa protein should be plasma glutathione peroxidase (p-Gpx), Se content was about 21.1-24.3%.Experimental- Sample Collection and Pretreatment: Human blood sample_ serum, plasma- Selenium DeterminationFraction digestion① CEM microwave digestion system (Model MDS-2000) with temp 200℃② pooled fraction : mixedssolve 100mg of DAN in 100ml of 0.1M HCl5) Extracted with 25ml cyclohexan 5 times (Stored in cool and lightproof condition)6) Heat at 50℃ for 20min7) Fluorescent derivative, naphtho-selenodiazol, was extracted into 0.5ml of cyclohexane.8) Injected into HPLC, 100ul기기조건HPLC : Waters 201HPLC W/510Detector : Shimadzu RF-535 fluorescence detector at 366/520nmcolumn : u-Porasil C18-NH2 columnmobile phase : cyclohexan : tetrahydrofuran (9:1, v/v)Results and DiscussionSe Amounts(ng) in the Five Selenium-Containing Proteins of Human Serum from 4 Healthy Adults (n=3)samples123468±3K (albumin)0.12±0.010.15±0.020.29±0.120.22±0.0857.5±2.5K(selenoprotein)0.58±0.050.76±0.130.80±0.151.00±0.2047±2K0.19±0.060.44±0.050.78±0.151.09±0.0241±1K0.31±0.040.30±0.080.37±0.120.44±0.1021.5±K (GPx)0.32±0.060.50±0.110.72±0.140.75±0.04The 21±1 kDa band should be the subunit of p-GPx.Distribution of Selenium-Containing Proteins in Plasma (Serum)samplesalbumin(SelAlb)selenoprotein(SelP)p-GPx40-42kDa(SelCys)Ref.Human (petween glutathione peroxidase, selenoprotein P, and albumin in plasma, Anal Biochem, 208, 176-181 (1993)12. I. Harrison, D.Littlejohn, and G.S. Fell, Distribution of selenium in human blood plasma and serum, analyst 121, 189-194 (1996)13. T.Plecko, S.Nordmann, M. RKgauer, et al. Determination and distribution of human plasma selehoproteins, Fresenius J. Anal Chem 363, 517-519 (1999)Reference-2A systematic approach to the accurate quantification of selenium in serum selenoprotein by HPLC-ICP-MSIntroduction- selenium status : plasma, serum selenium concentration, plasma glutathione peroxidase (GPx) activity- Serum is the most accessible bio-indicator for selenium level- Selenium is incorporated as selenocysteine (SeCys), GPx and Selenoprotein (SelP) and Selenoalbumin (SeAlb)Instrumentation- SpectraSystem p4000 HPLC (Thermo Fisher Scientific Inc., MA, USA)- Synergi Hydro-RP C18 RP-HPLC column : 15cm x 4.6mm id x 4um (Phenomenex, Le Pecq, France)기기조건Cloumn : Hitrap Heparin-Sepharose (HEP) orage- serum- serum samples were filtered before the analysis by means of 0.45um cellulose acetate syringe filtersConcentration of selenium in SeAlb, GPx and SelP of BCR-637 serum obtained by AF-HPLC coupled to CRC ICP-QMS and in AF-HPLC fraction analyzed by FIA and CRC ICP-QMSSe(ng/g)AF-HPLCFIAGPx11 ± 18.7 ± 2.1SelP54 ± 251 ± 1SeAlb12 ± 113 ± 1GPx+SelP+SeAlb77± 273 ± 3Total Se83 ± 280 ± 3Reference-3Simultaneous speciation analysis of glutathione peroxidase, selenoprotein P and selenoalbumon in human serum by tandem anion exchange-affinity HPLC and on-line isotope dilution ICP quadrupole MSIntroduction- Selenium has been one of the most widely investigated of all the trace element nutrients- mainly due to role in cnacer prevention- Selenium is incorporated as selenocysteine (SeCys), GPx and Selenoprotein (SelP) and Selenoalbumin (SeAlb)Sample preparation and storage- serumby centrifugation of freshly collected blood at 3,000g for 10minstored at -20℃ until analysisfiltered just before a분으로 글루타치온을 보유한다. 환원형 글루타치온인 GSH를 산화시켜 2황화 글루타치온 (GSSG)를 생성하고 글루타치온 환원효소 (GRD, Glutathione reductase)가 GSSG를 다시 환원시켜 GSH로 전환시킨다.글루타치온 산화 환원 싸이클 (redox cycle)은 세포질 내 과산화물의 환원반응에 핵심적 기전이다.GSH는 글루탐산염 (glutamate), 시스테인(cysteine) 및 글라이신(glycine)등 아미노산으로 구성된 트리펩타이드(Tripeptide)이다. GSSG는 세포 내 과산화물과 반응하는 과정에서 형성된다.구조글루타치온은 필수 영양소가 아니다. L-cysteine, L-glutamic acid, glycine 등 아미노산을 원료로 체내에서 만들어내기 때문이다. 이때 2분자의 ATP가 필요하다. GPxsms 셀레늄 함유 4중합체 (tetrameric) 당 단백질이다. 세포막이나 세포 소기관막의 통합성은 완전히 GPx에 달려있고 이 효소는 완전히 셀레늄 존재 여부에 의존한다.GPx의 타입GPx는 항산화 셀레늄 함유 효소(selenoenzymes)이다. GSH가 과산화물 (Hydroperoxide)을 환원시켜 산화 스트레스를 방지한다. GPx (cytosolic GPx : 세포질), PHGPx (phospholipid hydroperoxide GPx : 인지질), pGPx (plasma GPx : 혈장) 그리고 giGPx (gastrointestinal GPx : 위장관) 등 4종류의 동질효소 (isozyme)가 존재하며 서로 다른 유전자에 의해 코딩된다. 이들은 모두 활성 부위에 셀레늄을 함유하고 있어 촉매기능을 수행한다. 이 효소의 활성은 과산화물과 타이올(thiol) 보조 효소에 따라 상당한 차이가 있다.GPx의 성질GPx는 4중합체 당 단백질로 분자량이 85,000D 이며 selenocysteine인 아미노산 잔기 4분자와 셀레늄 원자 4개가 들어있다. 이 셀레늄 원자가 촉매 활성을 보인다. 글루타치온 과산화쇼소의 필수성분다.
Cell isolation methods목차1. Brain2. Liver3. Lung4. Kidney5. spleen6. Bone marrow7. Blood? Brain1. BRAIN을 꺼내서 수막제거후 CORTEX부분만 적출한다.2. cold PBS (1.37mM NaCl, 4.3mM Na2HPO4, 0.024M Na2EDTA) 에 4번 washing3. 적출한 CORTEX부분을 1X HBSS에 넣는다.3. small pieces (250-500mg) 의 brain tissue를 petridish 에 tissue 조각을 넣고 가위 등으로 chopping.4. 조각난 CORTEX를 75cm2 flask에 총량이 10ml이 되게 1X HBSS를 넣고 80rpm에서 10분동안 교반한다.5. 여기에 0.1% trypsin이 포함된 20ml 1x HBSS를 첨가하여 10~20 분 교반한다.( 잘게 부서진 조직이 점성을 가지고 서로 붙을 때까지..- Total Volume-30ml)6. 이렇게 점성을 보이는 primary cell을 10ml pipet으로 pipetting으로 분리시킨후 70um strainer를 이용하여 filtraion 한다.7. 이렇게 모아진 cell은 800rpm에서 5분동안 원심분리한다.reference : Tice et al (1998, Environmental and molecular mutagenesis)Isabelle Maniere et al (2005, Mutation Research)Cell isolation methods? Liver1. liver tissue 를 실험이 끝난 동물에서 적출한다.2. 적출한 liver 를 cold PBS (pH7.4) 로 rise 후 filter paper를 이용하여 dry 시킨다.3. 조직을 homogenization 이나 collagenase 처리 전까지 aluminium foil, on ice 상태를 유지한다.4. Minced liver tissue : 간 조직을 homogenization buNa2EDTA)5. Potter-Elvehjem glass homogenizer (GLAS-COL, GKH-GT Apparatus, Terre Haute, IN, USA) 를 이용하여 ice 위에서 부드럽게 homogenization 을 수행한다.6. For enzyme digestion,조직 1g당 10ml의 collagenase 을 첨가하여 shaking incubation, at 37℃, 50min 수행.7. Centrifuge at low speed at 40*g, 5min8. supernatant 만 걷어 내고 centrifuge (700*g, 10min) 수행한다.9. precipitate the cells, cell counting.10. immediately used for the comet assay.reference : Yu.F Sasaki et al. (2002, mutation research)Cell isolation methods? Lung1. mouse/rat 의 lung을 깨끗이 분리한다. (털과 혈액은 최대한 제거 할 것): 분리한 lung tissue는 R2 media 에 넣어 둔다2. lung tissue를 최대한 잘게 chopping(이 때 중간에 media를 아주 조금씩 부어 조직이 마르지 않도록 한다): chopping 할 때 dish를 6cm size를 사용하면 cell loss 를 줄일 수 있다.3. chopping 한 조직을 새 tube로 옮긴다.(lung tissue를 회수 할 경우 tip 끝을 조금 잘라서 최대한 옮길 수 있도록 한다)4. media 를 4ml 채우고, collagenase 40ul 첨가 후 shaking incubator 30min5. 상층액 (supernatant) 를 최대한 걷어 strainer 로 filtration 수행한다.(sup을 걷을 때, tip 끝부분을 잘라 수행. 근육이 뭉치면 하얗게 뭉치게 되는데 이것이 딸려오지 않도록 최대한 주의)6. strainer에 남겨진 조직을 회수(t~35ml? centrifuge 1700rpm, 4℃, 3min? sup. 제거? pellet 에 media를 조금 부어 on ice(Centrifuge 수행하기 전까지의 이 과정을 먼저 수행할 것)7. Strainer는 R2 media에 담가두고 조직을 회수한 tube는 다시 R2 4ml까지 채워 collagenase 40ul 첨가 ? shaking incubator, 30min8. 4~7번까지의 과정, 4~5 times9. 마지막으로 얻어진 pellet을 ACK buffer 5ml/ 5min (in waterbath)? centrifuge 1700rpm, 4℃, 3min? Sup 제거10. cell counting 및 plating, loading.Cell isolation methods? Kidney1. Kidney tissue 를 실험이 끝난 동물에서 적출한다.2. 적출한 Kidney 를 cold PBS (pH7.4) 로 rise 후 filter paper를 이용하여 dry 시킨다.3. 조직을 homogenization 이나 collagenase 처리 전까지 aluminium foil, on ice 상태를 유지한다.4. Minced liver tissue : Kidney 조직을 homogenization buffer* 에서 g 당 1ml 의 volume으로 하여 suspension 해 준다.* homogenization buffer (pH7.5) : 0.075M NaCl, 0.024M Na2EDTA)5. Potter-Elvehjem glass homogenizer (GLAS-COL, GKH-GT Apparatus, Terre Haute, IN, USA) 를 이용하여 ice 위에서 부드럽게 homogenization 을 수행한다.6. For enzyme digestion,조직 1g당 10ml의 collagenase 을 첨가하여 shaking incubation, at 37℃, 50min 수행.7. Centrifuge at low speed at 40*g,. immediately used for the comet assay.reference : Yu.F Sasaki et al. (2002, mutation research)Cell isolation methods? Spleen1. 실험이 끝난 동물에서 spleen 을 적출한다. (털, 혈액, 지방 등을 제거)2. spleen tissue homgenization 수행1) cold PBS (pH7.4) 를 주사기를 이용하여 spleen 조직내에 주입시켜 cell이 빠져 나오도록 한다.2) cold mince solution (HBSS with 20mM EDTA, 10% DMSO) 에 tissue를 담아 homogenizer 를 이용하여 으깬다.3. media 를 4ml 채우고, collagenase 40ul 첨가 후 shaking incubator, at 37℃, 30min4. 상층액을 최대한 걷어 strainer에서 filtration 수행.5. strainer를 통과한 cell + media up to 30~35ml? centrifuge 1700rpm, 4℃, 3min? sup. 제거? pellet 에 media를 조금 부어 on ice(Centrifuge 수행하기 전까지의 이 과정을 먼저 수행할 것)7. Strainer는 R2 media에 담가두고 조직을 회수한 tube는 다시 R2 4ml까지 채워 collagenase 40ul 첨가 ? shaking incubator, 30min8. 4~7번까지의 과정, 4~5 times9. 마지막으로 얻어진 pellet을 ACK buffer 5ml/ 5min (in waterbath)? centrifuge 1700rpm, 4℃, 3min? Sup 제거10. cell counting 및 plating, loading.reference : Paola Leopardi et al. (2010, Mutagenesis)Cell isolation methods? Bone marrow1. 동물의 넓적다리를 적출한다.다리에 붙은 털과 지뼈 사이에 삽입하여 cell을 분리시킨다.3. 여러번 삽입 후 통과되어 나온 cell + PBS 를 tube에 모은다.4. up to 30ml (PBS)5. Centrifuge 2000rpm, 10min6. pellet (bone marrow cells)7. PBS로 washing 후 centrifuge를 재 수행한다.8. 최종적으로 얻은 pellet 이 bone marrow cell이 된다.9. cell counting.10. immediately used for the comet assay.reference : Yu.F Sasaki et al. (2002, mutation research)Cell isolation methods? BloodMethod I1. 동물 심장에서 heparin tube에 혈액을 채취한다. (3ml ~ 5ml, rat기준)2. Isolated lymphocytes1) 20ul whole blood with 1ml RPMI1640, add 100ul Ficoll(ex. 1ml WB. with 5ml + 500ul Ficoll)2) Centrifuge at 2000*g, 3min3) Ficoll layer의 상층의 lymphocyte 층 (하얀띠) 부분에서 100ul 을 딴다.3) 하얀띠 부분을 걷어낸 100ul에 media 1ml을 추가하여 mix한다.4) Centrifuge at 2000*g, 3min 수행5) pellet 부분이 lymphocyte 이며, cell counting 후 사용한다.reference : R.R. Tice et al (1998, Environmental and molecular mutagenesis)Methods II1. 동물 심장(cardiac)에서 혈액을 채취한다. (3ml~5ml, rat기준)2, Isolated lymphocytes1) 1ml whole blood with 1ml RPMI1640, add 2ml Ficoll2) Centrifuge at 1800rpm, 20min3) Ficoll 에 n
Superoxide dismutase 기기분석
Glutathione peroxidase
