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생화학실습 실험보고서 DNA gel 전기영동

실험11. DNA gel 전기영동1. 실험목적제한효소를 이용해 DNA를 절단하고 전기영동한다.2. 이론제한효소: 원하는 염기서열의 DNA를 자를 수 있다.-튜브내에 녹아있는 DNA에 제한효소를 넣어서 특정한 자리에서 DNA를 자른다.-linear한 DNA생성.-전기영동agarose gel (다공성 폴리머 negative->positive): 전기영동법(gel electrophoresis)에 사용되는 한천을 이용하여 제조하는 3차원 구조의 겔을 의미한다.전기영동:분자량이 클수록 멀리가지못하고 사이즈가 작을수록 멀리까지 감. 정확한 사이즈를 알고있는 마커를 로딩시키면 사이즈도 예측할 수 있다.다이: 전기영동시 어디까지 가고있는지 알 수 있다.3. 실험방법사용한시약: 제한효소 BamH I, B buffer, DDW, sample A, gel loading dye, 1X TAE buffer, agarose, DNA marker, sample B, EtBr solution사용한기구: e-tube, 마이크로 피펫, 오븐, mini centrifuge, 삼각플라스크, 랩, tray, comb, running chamber,UV transiluminator1X TAE buffer: Tris acetate-EDTA, DNA의 운반에 필요한 이온을 공급해주는 역할. Tris- 양이온을 공급해 ? 전하를 띠는 DNA를 끌어주는 역할. Acetate-Tris의 높은 pH를 낮춰 DNA해리를 억제. EDTA- chelate로싸 DNA분해억제, DNA ?전하 유지1. micro tube에 B buffer 1마이크로리터(활성을 도와줌), DNA 1.5마이크로리터, BamH1 1마이크로리터(제한효소), DDW 6.5마이크로리터를 넣고 잘 섞어준 후 잠깐 centrifuge(원심분리).2. 37도씨에서 1시간동안 incubation한다.3. sample에 gel loading buffer를 넣고 섞어준다. (blue/orange 6x사용)1. agarose 0.5g을 삼각플라스크에 넣고 50ml의 1X TAE buffer를 가한다. (1% gel)(퍼센테이지가 올라갈수록 단단해져서 구멍이 작아진다. 작은사이즈의 벡터를 분석할땐 퍼센트가 높은거 사용)2. 삼각플라스크의 입구를 랩으로 싸고 구멍을 뚫은 후 약 2분간 전자레인지로 가열한다.3. agarose 용액을 약간 식힌 후 수평을 맞춘 tray에 붓고 comb를 꽂아 굳힌다.4. gel이 굳으면 comb을 빼고 chamber에 넣고 TAE buffer를 gel이 잠길 만큼 붓는다.1. DNA marker와 sample을 well에 넘치지 않도록 loading한다.2. 뚜ㄲ?ㅇ을 덮고 전기영동을 시작한다.3. gel의 1/2 지점을 지나면 멈춘다.1. 전기영동이 끝난 젤을 EtBr solution(0.5마이크로g/ml)에 10분간 담가둔다.2. EtBr을 수거하고 uv 일루미레이터로 관찰한다.

자연과학| 2022.04.04| 3페이지| 1,000원| 조회(261)

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생화학실습 실험보고서- 형광현미경을 통한 세포의 관찰

실험6. 형광 현미경을 통한 세포의 관찰1. 실험목적세포에 DAPI로 형광염색 후 관찰한다.2. 이론DAPI: 4′,6-diamidino-2-phenylindo. 파노마약제 탐색을 위해 합성한 형광성색소로 460nm에서 청색광을 갖는다(여기파장 360nm), 현재 형광현미경하에서 DNA검출 (엽록소, 바이러스, 마이코플라스마, 효모위미토콘드리아, 염색체내 DNA 등)에 사용하고 있다.3. 실험방법사용한 시약: media, PBS, Triton X-100, DAPI사용한 기구: well, 피펫, ice 볼, cover glass, 핀셋, 은박지, 슬라이드 글라스, 형광현미경media: 배지. 미생물 또는 동, 식물 조직 및 세포의 성장을 지원하기 위해 배양체가 필요로 하는 영양물질을 주성분으로 하여 고안된 다양한 형태의 물질PBS: phosphate buffer saline의 약자. 생리 식염액만으로는 그 생명을 오래 유지할 수 없는 생물 또는 조직이나 기관의 부유액으로서 이용Triton X-100:비누같은 성분으로 형광 물질이 세포에 잘 들어가게 해준다.피펫: 작은 양의 액체를 옮기는 데 사용형광현미경: 시료에 존재하는 형광물질이 흡수하는 특정 파장을 비추었을 때 형광물질이 흡수한 빛이 형광 형태로 나오는 긴 파장의 빛을 감지하여 이미징 함1- well의 media을 버리고 각 well을 PBS 2ml로 워싱*well에 PBS를 가할 때에는 cover glass에 붙어 있는 cell이 떨어지는 것을 막기 위하여 벽면에 대고 넣는 것이 좋다.2- 3~4% parafomaldehyde(in PBS) 1ml넣고 15분동안 incubation.3- ice cold PBS로 워싱하고 5분동안 상온에 두는 것(incubation)을 두 번 반복한다.4- 0.25% Triton X-100 포함한 PBS를 well 마다 1ml씩 넣고 5분 동안 incubation5- 4-의 detergent를 버리고 PBS로 5분씩 두 번 워싱(3-방법과 동일)6- 10ml PBS+DAPI(염색시약) 0.3~가 혼합된 용액을 1ml씩 well에 넣고 은박지로 감싼 뒤 5분간 살짝 shaking.7- PBS 2ml를 넣고 3번 정도 워싱8- 소독한 핀셋으로 cover glass를 꺼내 소독된 슬라이드 글라스에 밀착시킨다.

자연과학| 2022.04.04| 2페이지| 1,000원| 조회(365)

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생화학실습 실험보고서- 아미노산의 분리, 종이 크로마토그래피를 이용한 아미노산의 분리실험

실험3. 아미노산의 분리-종이크로마토그래피를 이용한 아미노산의 분리 실험1.실험목적종이크로마토그래피를 이용해 아미노산을 분리해 낸다.2. 이론1) 화학에서 분리와 분석이 중요한 이유-화학의 궁극적인 관심사는 원자의 재배열을 통한 화학적 변화이다. 화학적 변화는 곧 새로운 화합물의 생성을 의미함.-화학적 변화를 조사하기 위해서는 반응물과 생성물의 종류와 양적 변화를 측정(분석)하는 것이 필수적.-분석을 위해서는 대상 물질을 우선 분리하는 것이 유리함 (섞여 있을 때보다 관찰 하기가 쉬우므로)-화합물의 특성을 잘 이용하여 다양한 분리방법을 적절히 활용하는 것이 바람직함.2)분리에 중요한 요소-전자를 매개로 하여 이루어지는 화학 결합의 특성은 전자가 어느 쪽으로 끌리는가에 따라 크게 좌우됨.예)수소와 산소(물에서 같이), 염소(염화수소), 질소(암모니아) 사이의 공유결합은 극성을 가지고, 수소와 탄소 사이의 결합은 극성이 낮다. 이러한 특징은물질의 분리에 중요한 요소로 이용됨.3)크로마토그래피-분리에 가장 광범위하게 사용되는 방법이다. 핵심 원리는 극성은 극성끼리, 비극성은 비극성끼리 끌린다는 것이다.-두가지 원리: 정상 크로마토그래피(극성). 역상 크로마토그래피(비극성)-mobile phase: 이동상-stationaty phase: 고정상-크로마토그래피의 종류(solute와 stationary phase간의 interaction에 따라 분류함)① Adsorption chromatography->가장 오래된 크로마토그래피로써 solid표면에 있는 stationary phase에 부착② Partition chromatography->stationary phase와 mobile phase사이에 평형 형성하는 경우③ Ion-exchange chromatography->resin: Anions -SO3- or -COO-,Cations -N(CH3)3+->electrostatic interaction에 의한 partitioning④ Molecular exclusive chromatography-> gel filtration / gel permeation-> separation molecules by size⑤ Affinity chromatography-> solute와 stationary phase 간의 specific interaction을 하는 경우-> enzyme ? substrate antigen ? antibody4) 배경-분리는 정지상에 이동상을 흘려주면서 이루어진다.정지상: 크로마토그래피에 흡착된 물이동상: 알코올과 물의 혼합용액-고정상이 더 좋으면 고정상에 흡착, 이동상이 더 좋으면 이동상을 따라 이동분리되어질 아미노산들은 정지상과 이동상에 서로 다르게 분배되기 때문에 이동상이 종이를 따라 전개될 때 서로 다른 속도로 움직이게 된다. 이러한 분리 방법을 종이 크로마토그래피라고 한다.-분리할 아미노산들의 혼합물의 아주 소량을 크로마토그래피 종이의 한 쪽 끝에 찍는다. 이 지점을 연필로 표시하고 원점으로 한다. 밑 부분에 점을 찍은 종이를 분리에 사용되는 용매와 함께 닫힌 용기에 넣는다.사용되는 용매는 알코올과 물이 4:1의 비율로 섞여있다. 용매는 모세관 작용에 의해 위로 이동한다.종이 무게의 30% 정도를 차지하는 물은정지상으로, 알코올과 물의 혼합 용액은 이동상으로 작용한다.-용매 내의 아미노산들의 분리, 이동 속도는 아미노산의 물에 대한 친화도와 알코올/물 혼합 용액에 대한 친화도의 상대적인 값에 의존한다.물에 잘 녹는 극성이 아주 큰 아미노산은 정지상에 더 많이 분배되고, 아주 천천히 이동한다. 극성이 덜한 아미노산은 이동상을 따라 더 위로 이동하게 된다.-특정한 실험조건(용매, 고정상의 종류,온도 등)에서 화합물의 이동성은 Rf 값으로 정량적으로 표현됨.Rf=(성분 물질이 움직인 거리/용매가 움직인 거리): 종이의 성질, 온도, 시료의 양, 외부 물질, 물의 포화정도, 전개 용매의 성질 등3. 실험기기 및 시약1)전개 용매 (각 10 ml씩)에탄올 : 물 (4:1), n-프로판올 : 물 (4:1)n-프로판올 : 0.1 N HCl (4:1),n-프로판올 : 2% NH3 (4:1)2)20mM 아미노산 : 혼합물, Ala, Asp, His.3) 닌히드린 용액 : 95% 에탄올 용액 100ml에 닌히드린 2g을 녹인 용액(빛에 약하기 때문에, 외부 빛으로부터 차단되게 보관, 사용한다).4) 종이크로마토그래피용 종이, 500ml 비커 4개,랩, 끈, 테이프, 자, 모세관4. 실험방법1) 크로마토그래피 종이의 위쪽 끝에서 1.5cm되는 곳을 접은 다음, 아래로부터 1cm 되는 곳에 연필로 선을 긋는다. 종이의 옆선과는 0.5cm, 점과 점 사이는 1cm가 되도록 두 점을 역시 연필로 표시한다. 이와 같은 방법으로 모두 8장을 준비한다. 각 점에는 무엇을 전개시킬 것인지 연필로 써 두는 것이 좋다. (볼펜, 싸인펜, 네임펜 등을 사용하지 말 것.)2) 모세관으로 아미노산 혼합 용액을 빨아들인 후, 1에서 준비한 종이의 한 점에 가볍게 찍는다. 이 과정을 적어도 2-3번 반복하는데, 앞에 찍은 점이 다 마른 후에 새로운 점을 찍도록 한다. 이 때 sample spot이 1mm가 넘지 않도록 주의한다. 모세관에 남은 용액은 거름 종이(또는 휴지)로 뽑아내고, 증류수(또는 아세톤)로 서너차례 헹구어준다. (이 때, 모세관을 부러뜨리지 않도록 주의 할 것.)3) 50mM Ala, Asp, His 용액도 위와 같은 방법으로 종이 위에 올린 후, 완전히 말린다.4) 2 - 3의 과정을 3번 더 반복하여 총 8장의 종이를 만든다. 하나의 용액을 사용하는 모세관으로 다른 종이에 spotting을 마친 후에 다른 용액으로 넘어가는 것이 편하다.5) 500mL 비커 하나에 첫 번째 전개 용매 10ml를 넣는다. 다음 비커에는 두 번째 전개 용매 10ml를 넣는 등 같은 식으로 비커4개를 준비한다.

자연과학| 2022.04.04| 4페이지| 1,000원| 조회(347)

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생화학실습 실험보고서 아미노산 적정

실험 2. 아미노산의 적정1.실험 목적다양한 아미노산에 대하여 NaOH용액으로 적정한 그래프를 얻어 각 아미노산의 pKa값과 당량점을 구하고 실험에 쓰인 아미노산을 알아낸다.2.이론Henderson - Hasselbalch equation:아미노산의 pKa 는 수용액 내의 짝산과 짝염기의 농도가 같을 때의 pH 적정곡선 상에서는 염기를 가하여도 pH가 그다지 변화하지 않는 변곡점에서의 pH가 아미노산의 pKa 아미노산용액을 염기성 용액으로 적정하면 적정곡선을 통해서 당량점과 pKa를 찾을 수 있다.적정곡선: 적정(titration)의 결과를 그래프로 나타낸 것을 적정곡선(titration curve)이라고 한다. 적정은 일반적으로 어떤 물질의 농도를 결정하고자 할 때, 농도를 알고 있는 물질을 이용하여 알아내는 정량분석화학의 한 방법이다. 예를 들어 산-염기(acid-base) 적정의 경우 부피는 알고 농도를 모르는 산의 농도를 구하고자 하면, 농도를 알고 있는 염기로 적정하면서 소요되는 부피를 이용하여 산의 농도를 구할 수 있다. 이때 X축은 첨가되는 염기의 부피가 되고, Y축은 pH의 적정곡선을 그리게 된다.아미노산: 아미노산은 단백질을 구성하는 기본 단위이며, 단백질 합성에 사용되는 20 종의 아미노산은 각각 다양한 화학적 특성을 나타낸다. 특정 단백질을 구성하는 아미노산의 종류와 서열은 단백질을 암호화하는 유전자의 염기 서열에 의해 결정된다. 단백질의 생물학적 기능과 구조는 포함된 아미노산과 그 서열에 의하여 결정된다.Lysine: 20가지 아미노산 중 하나로 Basic한 아미노산이다.Alanine: 20가지 아미노산 중 하나로 Non-polar한 아미노산이다.Aspartic acid: 20가지 아미노산 중 하나로 Acidic한 아미노산이다.pKa: 약산의 해리 상수(Ka)를 나타내는 상수대수의 절대치. pKa=-logKa당량점: 중화반응을 포함한 모든 적정에서 적정당하는 물질과 적정하는 물질사이에 양적인 관계를 이론적으로 계산해서 구한 점pI: a net charge가 0일 때. pI=(pK1+pK2)/23.실험방법사용한 시약: 미지의 amino acid solution 0.1M, NaOH시료, 증류수,사용한 기구: 50 ml 뷰렛, 10 ml 피펫과 피펫 필러, 100 ml 비이커, 저울 (0.001까지 측정),pH미터, 유산지, 약수저, 클램프, 스탠드1)0.5M의 NaOH 용액 100ml를 제조한다. (NaOH 2g)2)pH미터를 보정한다.3)0.5M NaOH 용액으로 뷰렛 세척 후 뷰렛에 채운다.4)0.1M 미지의 amino acid solution 10ml에 NaOH용액을 0.5ml씩 떨어뜨리면서 그때마다의 pH를 측정하고 기록한다.5)4에서 얻은 데이터를 이용하여 적정그래프를 그리고 대략적인 pKa값과 당량점, 사용한 아미노산이 무엇인지 알아낸다.4.결과[측정값]pKa1pKa2pKa3pI1조2411.33아스파틱산2조1.910.2512.611.2리신3조1.9106알라닌4조2.210.112.711.4리신[측정값, 이론값]pKa1pKa2pKa3pI알라닌이론값2.49.76.0실험값1.910.06.0리신이론값2.29.010.59.7실험값2.110.212.711.3아스파틱산이론값2.13.99.82.8실험값2.04.011.33.0[측정값]1조(아스파틱산)2조(리신)3조(알라닌)4조(리신)적정하기 직전의 pH0.550.920.650.38당량점에서의pH-1차 당량점에서의 pH (pKa1+pKa2)/236.166.22차 당량점에서의 pH (pKa2+pKa3)/27.711.4-11.4당량점을 훨씬 지난 후의 pH13.1813.2612.113.225. 고찰아미노산의 pKa를 이용해 미지시료가 어떤 용액인지 파악하는 적정실험이다. 조별로 다른 미지시료용액을 측정했고 그 측정 값을 이용한 그래프를 통해 각 미지시료를 유추할 수 있다.용액 별 pK1,pK2,pK3,pI를 계산했다. 결과적으로 1조 아스파틱 산 2조 리신 3조 알라닌 4조 리신용액임을 알 수 있다. 아스파틱산 용액의 경우 pK1과 pK2의 값이 명확하게 분별되지 않는 곡선이 나타났다.

자연과학| 2022.04.04| 3페이지| 1,000원| 조회(381)

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생화학실습 실험보고서 박테리아의 형질전환 평가A+최고예요

실험9. 박테리아의 형질전환1. 실험목적박테리아의 유전형질을 플라스미드를 이용한 유전자 도입방법으로 전환시키는 방법을 익히고 실제로 형질 전환이 되었는지 살펴본다.2. 이론1)클로닝동식물의 한 개체에서 수정을 거치지 않고, 무성생식에 의해 양친과 똑같은 유전자 조성을 가진 개체를 얻는 기술을 말한다. 그 개체군을 클론이라고 한다. 클로닝은 암수의 유전자가 서로 섞이지 않으므로 우수한 품종을 보존하기 위한 가장 좋은 방법이다.2)박테리아의 형질전환플라스미드 DNA를 세포 내로 넣어주는 작업3)플라스미드를 이용한 인공적인 형질전환박테리아의 세포막에 PLG처리를 한다. 이렇게 처리된 박테리아는 competent cell이라 한다. competent cell에 DNA를 섞어주고 고농도의 2가 양이온 CaCl2와 heat shock을 주면 DNA가 competent cell 내부로 들어간다. 형질전환된 박테리아를 형질전환되지 않은 박테리아와 선별하기 위해 외부의 DNA에 selectable marker유전자인 임피실린 저항 유전자를 이용한다. 형질전환된 박테리아는 항생제인 임피실린에 대해 저항성을 가져 임피실린이 들어있는 배지에서 자라지만 형질전환이 안 된 박테리아는 임피실린 배지에서 자라지 못한다.4)콜로니세균 등이 고체형배지에서 육안으로 볼 수 있는 집단.5)재조합 DNA의 도입에 이용되는 모델생물세균(bacteria)으로는 대장균(E. coli)이 대표적이다. 출아효모(Saccharomyces)는 진핵생물 숙주로 흔히 사용되며 식물세포는 미분화된 전능한 세포인 줄기세포를 만들 수 있다. 배양된 동물세포는 사람이나 동물 유전자의 발현 연구에 사용되고 완전한 형질전환 생물도 제조할 수 있다.6)플라스미드 벡터작고 조작하기 쉬우며 한 번만 나타나는 한 종류 이상의 제한효소 인식서열을 갖고 있다. 많은 플라스미드는 선택표지인 항생제에 내성 유전자를 갖고 있는데 이는 세균의 복제기점(ori )을 갖고 있어 숙주의 염색체와 독립적으로 복제된다. 세균은 수백 벌의 재조합 플라스미드를 가질 수 있다. 유전자를 증폭하는 세균의 형질전환 능력은 매우 뛰어나다. 세균의 세포 내에 염색체와는 별개로 존재하면서 독자적으로 증식할 수 있는 DNA의 고리모양인 유전자이다. 세균의 생존에 플라스미드의 존재가 필수적인 것이 아니며 또 플라스미드는 다른 종의 세포 내에도 전달된다. 플라스미드는 유전자 클로닝을 위한 벡터로 많이 사용되는 것 중 하나이다. 벡터란 유전자 클로닝 할 때 우리가 원하는 유전자를 숙주 세포 안으로 이동시켜 그 안에서 다량으로 복제 가능하도록 하는 일종의 운반체를 말한다. 플라스미드는 그를 위한 조건을 가지고 있다. 우선 자가복제를 위한 복제기점을 가지고 있고, 유전자의 발현, 삽입된 유전자의 전사를 유도하는 promoter, 나중에 세포 배양에 의한 대량 생산 후에 플라스미드가 들어간 세포와 그렇지 않은 세포를 구별해 내기 위한 seletive marker, 원하는 유전자를 끼워 넣을 수 있는 insertion site등을 가지고 있다. insertion site는 제한 효소에 의해 잘려질 수 있는 부위인데 이곳으로 우리가 복제를 원하는 유전자를 삽입할 수 있다.7)재조합 DNA를 삽입하는 방법화학적 처리: 세포를 화학적으로 처리하여 원형질막을 투과성으로 만들면, DNA는 세포 내로 확산된다.전기천공법(electroporation): 순간적인 전기충격이 막에 일시적 구멍을 만들어 DNA를 들어가게 한다.8)새로운 DNA는 숙주세포가 분열할 때 복제되어야한다.DNA 중합효소는 아무 서열과 결합하지 않는다. 새로운 DNA는 복제단위(replicon 혹은 replication unit)이라는 복제기점을가진 서열의 일부를 가져야 한다. 새로운 DNA는 두 가지 방식으로 복제단위의 일부가된다. 숙주 염색체의 복제기점 근처에 삽입된다.9)반응능 대장균 세포 Competent cell (몹시 찬 염용액에 담근 대장균 세포가 담그지 않은 세포보다 DNA도입을 효과적으로 수행)10)형질 전환된 세포의 선택Plasmid가 지닌 선별 표식자 사용:Ampicillin을 포함하는 배지를 깔아주면 형질전환된(플라스미드를가진) 세포만 살아남는다.삽입 비활성화 방법: 재조합되지 않은 벡터분자는 숙주세포가 생성물을 만든다. 재조합분자는 삽입되어 불활성화한 유전자에 의해 특성이 나타나지 않는다.11)항생제 내성 유전자의 삽입 비활성화필요한 유전자가 들어가고 나면 벡터 갈락토시데이즈가 정상적으로 만들어 질 수 없다.(효소 비활성화)3. 실험방법사용한 시약: competent cell, 외래 DNA(PGL), LB배지, 얼음, 균액, 고체배지, 95%에탄올,사용한 기구: 마이크로피펫, e-tube, 가열기, 오븐. LB plate, 알코올램프, 도말봉, 피펫팁1.-80℃(deep freezer)에 보관되어있는 competent cell을 꺼내어 ice에서 1/3정도 녹인다.2.e-tube에 competent cell 50μl와 외래 DNA(PGL)를 1μl를 넣어준 뒤 30분간 얼음에 넣어둔다.3.42도씨에서 1분 30초간 heat shock한다.4.100μl의 LB배지를 넣어준다.5.위의 tube를 오븐(37도씨)에 넣고 1시간동안 배양한다.6.원액과 10배 희석액을 각각 75μl씩 취해 LB plate(ampicillin함유)에 도말한다.*도말: plate에 굳힌 배지에 균액을 스며들도록 접종하여 배양시키는 방법으로 single colony를 얻는데 사용된다. 도말 방법에는 크게 평판도말과 획선도말이 있다.- 평판도말 : 생성된 콜로니의 수를 정확히 계수하기 위해 쓰이며, 얇게 펴발라 접종한다.- 획선도말 : 배지에 특정 콜로니 하나만 배양시킬 때 많이쓰이며, 루프를 사용한다.+평판도말 하는 방법1.마이크로피펫으로 세균을 증균시킨 증균액을 소량 취하여 배지 위에 균액을 분주한다.2.도말봉을 아래 위로 움직여 균액을 넓게 펴준다. 도말봉을 문지를 때 느낌이 매끈하다가 거친 느낌이 나기 시작하면 균액이 모두 흡수된 것.

자연과학| 2022.04.04| 4페이지| 1,000원| 조회(282)

플라스미드, 형질전환, 생화학, 생화학실험, 생화학레포트, 생화학실습, 생화학실험레..

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