플라스미드 DNA의 정제와 증폭

소개

자연과학, 의학을 전공한 학생들에게 유용한 자료입니다.

목차

플라스미드 DNA의 정제와 증폭
(1) 크기에 기초한 분리
(2) 구조에 기초한 분리
1) 알칼리 변성
2) EtBr-CsCl 밀도 기울기 원심분리법
(3) 플라스미드 증폭

본문내용

박테리아 배양액으로부터 플라스미드를 정제하는 것은 세포전체 DNA제법과 같은 일반적인 방법을 포함한다. 플라스미드를 함유한 세포의 배양은 액체배지에서 키워서 세포 추출물이 제조된다. 추출물에서 단백질과 RNA가 제거되고 에탄올 침전법에 의해 DNA가 농축된다. 그렇지만, 플라스미드 정제와 세포 전체 DNA 제법 사이에는 중요한 차이가 있다. 플라스미드 정제에서는 세포에 존재하는 다량의 박테리아 염색체 DNA로부터 플라스미드 DNA를 분리시키는 것이 필요하다.
두 가지 형태의 DNA를 분리시키는 것은 매우 어렵지만, 플라스미드를 클로닝 운반체로써 사용한다면 필수 불가결한 것이다. 유전자 클로닝 실험에서 소량의 오염된 박테리아 DNA가 존재하는 것은 바람직하지 않은 결과를 쉽게 초래할 것이다. 다행스럽게도 플라스미드 정제 때 박테리아 DNA를 제거하는데 유용한 몇가지 방법이 있으며 이러한 방법을 개별적으로 혹은 혼합하여 사용하면 매우 순수한 플라스미드 DNA를 분리하는 결과를 가져 온다.
플라스미드 DNA와 박테리아 DNA사이에는 몇가지 물리적인 차이점에 기초한 이러한 방법들 중 가장 명백한 것은 크기이다. 가장 큰 플라스미드가 대장균 염색체 크기의 8%밖에 되지 않으며, 대부분은 그보다 훨씬 작다. 그러므로 큰 DNA분자로부터 작은 DNA분자를 분리하는 방법은 플라스미드 DNA를 효과적으로 정제시킬 수 있다.
크기뿐만 아니라, 플라스미드와 박테리아 DNA는 구조가 다르다. DNA와 같은 고분자에 적용될 때 구조라는 용어는 분자의 전체적인 공간 배열을 의미하는데, 선형과 원형의 두가지 간단한 구조가 있다. 플라스미드와 박테리아 염색체는 원형이지만 세포 추출물 제법 동안에 염색체는 항상 선형 단편으로 쪼개질 것이다. 선형분자로부터 원형분자를 분리하는 방법은 순수한 플라스미드를 얻는 결과를 가져올 것이다.

(1) 크기에 기초한 분리
세포 추출물의 제법 동안에 크기분류를 시도하는 것은 일상적인 단계이다. 세포가 아주 조심스럽게 조절된 조건에서 용해되어진다면, 염색체 DNA의 최소량만이 파손을 입을 것이다. 얻어진 DNA 단편은 여전히 아주 클 것이며, 플라스미드보다 훨씬 클 것이며 원심분리에 의해 세포 단편들과 함께 제거될 것이다. 박테리아 염색체가 세포 외피에 물리적으로 붙어 있으며, 이러한 접착이 깨어지지 않으면 세포 단편과 함께 침전되므로 이런 과정에 도움이 된다.

참고자료

· 없음