Southern blot, Northern blot

소개

실험이론
Genomic DNA에 존재하는 특정 유전자의 위치를 결정할 수 있는 방법. genomic DNA를 하나 혹은 여러가지 제한효소로 자른 다음 생성된 각 DNA 조각을 agarose gel 전기영동하여 크기별로 분리, gel 상에서 DNA를 변성시키고 gel -> solid support(흔히 nitrocellulose 혹은 nylon membrane)으로 이동시킨다. 이렇게 gel로부터 membrane으로 이동될 때 DNA조각들의 상대적인 위치는 유지되게 된다. Membrane에 부착된 DNA는 방사선 동위원소 혹은 비방사선 물질로 표지된 DNA 혹은 RNA(probe이라 부름)와 hybridization되고 자가방사법등을 통해 그 위치를 가시화하게 된다. 이러한 기술은 genomic DNA 뿐만 아니라 plasmid의 분석, cosmid, bacteriophage 등의 분석에도 적합한 방법이 될 수 있다.

※Agarose gel로부터 solid support로 DNA의 이동 방법
=>모세관 현상을 이용한 이동(Capillary transfer)

목차

1. Southern blot hybridization
1)실험이론
2)실험방법
A. Genomic DNA의 제한효소 절단
B. 모세관 현상을 이용한 Southern transfer

본문내용

A. Genomic DNA의 제한효소 절단
1. 분석하고자 하는 genomic DNA 10 μg과 반응완충용액 및 증류수를 혼합하여 총 194 μl로 만든다음 4°C에서 2시간 정도 방치해 둔다.
2. 4 μl의 제한효소를 가하고 조심스럽게 혼합한 뒤 37°C에 두시간 보관한다. 유리막대를 이용하여 혼합하는 것도 좋은 방법이다.
3. 다시 2 μl의 제한효소를 더 가하고 두시간 반응시킨다음 반응혼합물 부피의 1/10을 agarose gel 전기영동하여 효소반응이 잘 진행되었는지 확인한다.
4. Phenol:chloroform 추출을 실시하여 수용액층을 분리한 후 2.5배의 ethanol을 첨가하고 -20°C에 1시간 이상 보관한다.
5. 4°C에서 10,000 rpm의 속도로 10분간 원심분리한 후 상층액을 제거한 다음 침전물을 완전히 건조시키고 TE 용액 20 μl로 녹인다.
* 다음 단계에서 전기영동을 시행하기 위해 한 lane에 genomic DNA 약 10 μg이 필요하다. 그러므로 여러개의 lane에 시료를 가하기 위해서는 필요한 시료의 양을 잘 계산해야 한다.
* 실험단계를 간단히 하기 위해 과정 1의 4°C 방치와 과정 3, 4, 5를 생략할 수 있다. 필요에 따라 genomic DNA를 두가지 이상의 제한효소로 절단하여 실험할 수도 있다.

B. 모세관 현상을 이용한 Southern transfer
1. 위에서 준비된 제한효소로 절단된 genomic DNA 시료를 0.7% agarose gel에 가한 후 100 V 전압을 걸고 2시간 동안 전기영동한다.
2. 전기영동이 끝난 gel을 조심스럽게 플라스틱 통에 옮겨 증류수로 세척한다.
3. Ethdium bromide를 0.5 μg/ml의 농도로 가한 후 gel을 적당 시간(10분 이상) 염색한 후 자외선하에서 확인한다.
4. 변성용액(1.5 M NaCl, 0.5 M NaOH)에 gel이 충분히 담기도록 하여 천천히 흔들면서 45분간 방치하여 gel 내부의 DNA가 변성되도록 한다.
5. 증류수로 gel을 잠시 동안 세척한다.
6. Gel을 중화용액(1 M Tris-Cl, pH 7.4, 1.5 M NaCl)에 담가 상온에서 30분간 흔들어주면서 중화시킨다.
* Setting은 12장의 RNA 분석 편에 도해되어 있다.

참고자료

· 없음