RT-PCR

소개

PCR(polymer chain reaction)은 DNA의 원하는 부분을 증폭하는 방법이다. DNA molecule의 어느 부분이든지 그 border sequence만 알면 이 방법을 통해서 증폭할 수 있다. PCR은 기본적으로 denaturation, annealing, extension의 세 단계로 구성되어 있고, 이 과정이 반복되면서 DNA가 증폭된다. 기본적으로 PCR을 구성하고 있는 요소들에는 DNA template, primer, dNTP, polymerase등이 있으며, PCR 과정에서 그것의 sensitivity와 accuracy에 가장 영향을 미치는 것은 primer와 temperature이다.

목차

1. PCR의 각 과정
2. PCR의 구성요소
3. Studying PCR products
4. PCR의 종류

..
..

본문내용

1. PCR의 각 과정
(a) Denaturation
PCR의 가장 첫 단계이며, 온도가 높아짐에 따라 DNA의 염기 사이에 있는 수소결합이 끊어져 두가닥의 DNA가 분리된다. 일반적으로 94℃ 정도에서 1분간 진행된다.

(b) Annealing
각각 두가닥으로 분리된 DNA molecule에 primer가 붙는 과정이다. Primer는 그들과 상보적인 염기를 가지고 있는 DNA 서열에 달라붙는다. 이 과정이 바로 PCR의 accuracy를 결정짓는 단계이며, 어느 온도로 진행되는 가는 primer의 길이와 그것을 이루고 있는 염기의 종류에 따라 달라진다. 만약에 온도가 너무 높으면 primer가 DNA molecule에 잘 달라붙지 않아 그 효율이 떨어지며, 반대로 온도가 너무 낮을 경우에는 primer가 mismatch할 확률이 높아서 정확도가 그만큼 더 떨어진다. 일반적으로 온도는 아래의 식에서 결정되며, 여기서 trial & error 과정을 포함하여 좀 더 구체적으로 결정한다.
Tm = (4*[G+C]) + (2*[A+T])℃
여기서 G+C의 계수가 더 큰 이유는 그들이 A+T의 수소결합 보다 센 수소결합을 하기 때문이다.

(c) Extension
Primer로부터 DNA가 뻗어나가는 과정이다. 물론 template와 상보적 결합으로 인하여 뻗어나간다. 이때는 보통 74℃에서 2분간 진행되며, 이 온도가 Taq polymerase의 활성이 최대로 되는 온도이다.

2. PCR의 구성요소

(a) Primer
PCR의 가장 중요한 요소이며, 정확도를 결정한다. Primer의 길이는 너무 길어도 안되며 너무 짧아도 안된다. 너무 짧다면 인간의 genome처럼 많은 양의 nucleotide로 구성된 DNA molecule을 대상으로 할 경우, primer가 인식할 수 있는 site가 너무 많아서 원하는 부분만을 증폭하는 것이 불가능해진다. 반대로 너무 길다면 PCR 과정에서 DNA가 hybridizing할 때의 시간이 많이 걸려, 그 효율이 떨어진다. 일반적으로 17-30mer가 primer의 크기로 적당하다.

(b) polymerase
PCR에서 사용하는 polymerase는 Taq1 polymerase로 이것은 Themus aquaticus로부터 추출한 효소이다. 이 생명체는 바다 밑의 뜨거운 곳에서 사는데, 이 때문에 이 생물의 효소는 열에 저항성이 있다. 따라서 Taq1 polymerase 역시 열에 저항성이 높다. 이러한 성질이 PCR에서 이 polymerase를 쓰는 이유이다. 보통 PCR을 할 경우, denaturation 과정에서 온도가 94℃까지 올라가며, 대부분의 단백질은 이 온도에서 변성이 되어 그 기능을 상실한다. 하지만 Taq1 polymerase는 열에 저항성이 높기 때문에 이 온도에서도 변성이 되지 않는다 .

참고자료

· 없음