RT-PCR - 예비실험보고서

목차

1. 실험 제목
2. 실험 목적
3. 실험 원리

본문내용

실험 제목
RT-PCR

실험 목적
지난주에 isolation 했던 RNA를 이용하여 cDNA를 만드는 역전사 과정을 수행하여 원하는 target의 양을 PCR로 확인한다.

실험 원리
RT-PCR
DNA 에서는 exon과 intron이 있으므로 DNA를 template로 하는 경우에는 exon과 intron이 모두 증폭될 수 있다. 하지만 intron은 exon에 비해서 매우 크기 때문에 exon 중에 몇 개를 한꺼번에 증폭하려면 DNA로는 힘들다. 더구나 intron sequence는 일부를 제외하고는 중요성이 떨어진다고 인식되어 밝히지 않은 것이 많아 GenBank에서도 찾을 수 없는 경우가 많다. 이러한 이유 때문에 mRNA를 template로 해서 PCR하는 방법을 RT-PCR(Reverase Transcriptase-Polymerase Chain Reaction)이라고 합니다. 이 경우는 앞에서 설명한 PCR을 시행하기 이전에 RNA로부터 DNA를 합성해 주는 효소(RNA-dependent DNA polymerase)인 reverse transcriptase를 처리한다.

맨 먼저 reverse transcriptase로 RNA를 complementary DNA(cDNA)로 역한다. 이때는 downstream primer만 사용하게 되는데 왜냐하면 RNA는 single strand이기 때문이다. 그 후 생성된 cDNA에서 일반적인 PCR의 과정을 밟아서 유전자를 증폭한다.

Oligo(dT) primer를 쓰면 분리한 RNA 중 mRNA는 모두 cDNA로 만들어진다. 그리고 Gene specific primer를 사용하면 target gene만 cDNA로 만들어지게 된다. 그리고 random primer를 넣고 반응시키면 길이도 다양하고 모든 RNA(rRNA, tRNA 포함)가 모두 cDNA로 만들어진다.

참고 자료

미생물학실험서. 한국미생물학회. 을유문화사. 1998, pp485∼492.
생화학. D.L. Nelson, M.M. Cox 저. 박길홍 외 8인 역. 서울외국서적. 2002, pp136∼138, pp116
유전공학(제2판). J.D. Watson 외 3인 저. 박영순 외 5인 역. 탐구당. 2002, pp8 7∼93.