PCR-Mediated Mutagenesis

소개

PCR의 과정을 통하여 DNA를 mutagenesis한 뒤, 이를 E.coli에 insert한 뒤, 다시 ligation하여, 우리가 원하는 product를 얻는다.

목차

1. 실험제목

2. 실험일자

3. 제출지 및 공동 실험자

4. 목적

5. 원리

* PCR의 원리
* RT-PCR(reverse tran***ion-PCR)법의 원리
* PCR시 고려사항
① Pipetting & DNA template
② Setting up the Laboratory
③ PCR cycling program
④ Equipment (Thermocyclers & PCR tubes)
⑤ PCR reaction components
* Tm

6. 시약 및 기자재

1) 1번째 실험
2) 2번째 실험

7. 방법

1) 1번째 실험 (Overlap PCR)
2) 2번째 실험

8. 결과

9. 고찰

sticky end를 blunt end로 만드는 법
두 번째로 sticky end를 fill-in 해서 blunt end로 만드는 법

10. 참고문헌

본문내용

1. 실험제목

PCR-Mediated Mutagenesis

2. 실험일자

2006년 4월 3일, 4월 10일 (2회)

3. 제출지 및 공동 실험자



4. 목적

PCR의 과정을 통하여 DNA를 mutagenesis한 뒤, 이를 E.coli에 insert한 뒤, 다시 ligation하여, 우리가 원하는 product를 얻는다.

5. 원리

* PCR의 원리

폴리메라제 연쇄 반응(Plymerase chain reaction) : PCR법에 의해 세포·조직에서 아주 미량의 DNA를 추출해 특정영역 DNA를 증폭해 유전자 진단 등에 이용하는 것이 가능하다. 주형이 되는 double strand DNA의 표적 부분의 양끝 염기 배열 정보로부터 상류와 하류의 DNA primer를 합성하고 내열성 DNA polymerase(Taq polymerase)와 thermocycler를 이용해 PCR반응에 따른 특정 유전자 영역의 증폭을 실시한다. 이론적으로는 반응 사이클의 2n으로 증폭이 가능하다.
Han Taq은 Thermus aquaticus 균주로부터 DNA polymerase 유전자를 cloning하여 E.coli system을 이용해 대량 발현하여, 제넨메드만의 high technology로 정제한 DNA polymerase로서 천연의 Taq DNA polymerase와 동등한 기능을 갖고 있으며 독자적이 buffer condition으로 인해 뛰어난 Yield를 나타낸다.
① 반응액을 가열(94℃)하여 주형 DNA를 single strand로 한다.
② 냉각(55℃)하여 상하 DNA primer를 표적 배열의 양단에 결합시킨다.
③ 가열(72℃)하여 Taq polymerase가 주형 DNA로부터 상보적인 새로운 DNA 사슬을 합성하도록 한다.
④ 다시 반응액을 가열해 합성된 double strand DNA를 single strand로 한다. 이 공정을 thermocycler에서 반복한다.

* RT-PCR(reverse tran***ion-PCR)법의 원리

참고자료

· *http://rd.empas.com/k.tsp?/pcr%C0%C7+%BF%F8%B8%AE/D2:2:010100:A1EDC90A::t/i=5278875&sn=1211939764&q2=pcr+%BF%F8%B8%AE&dv=a&w=234c4d4e4c4e&dw=4c&vl=A&vn=0:%BE%DF%C8%C4:eq=1211939764%3A20040511::/*kr.ks.yahoo.com/service/wiki_know/know_view.html?tnum=131648
· *http://kin.naver.com/db/detail.php?d1id=11&dir_id=110205&eid=8VXA/eiL+5Aup7MHq1VOe0n5njWP4xX6
· *http://blog.naver.com/kidarime/100021064539
· *http://blog.naver.com/songjs2436?Redirect=Log&logNo=6937596