[생화학실험] PCR-Mediated Mutagenesis

목차

1. 실험 목적
2. 실험 이론 및 원리
3. 실험 기구 및 시약
4. 실험 방법
5. 실험 결과
6. 토의 사항
7. 참고 문헌

본문내용

1. 실험 목적
1.1. PCR의 종류와 원리에 대해서 알아보고 PCR-mediated deletion 실험을 통해 DNA의 원하는 부위를 제거하여 증폭할 수 있다.

2. 실험 이론 및 원리
2.1. PCR(Polymerase chain reaction)
PCR(polymerase chain reaction)은 DNA plymerase 반응을 연속적으로 수행하여 DNA를 증폭하는 방법이다. PCR은 기본적으로 세 단계 (denaturation, annealing, extension)로 구성되며, 이를 25-30번 반복 수행하면서 최고 약 1 백만 배까지 template DNA의 증폭을 얻게 된다.
2.1.1. Step 1: denaturation
① 90℃∼96℃로 가열하여 두가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리.
② 일반적으로 94℃사용: 높은 온도일수록 단일가닥 DNA로 잘 이행되지만 온도가 너무 높으면 Taq DNA polymerase 역시 activity(활성)가 낮아짐.
③ 첫 Cycle에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킴.
④ 이후의 cycle에서는 약 1분간 변성시킴.
2.1.2. Step 2 : annealing
① 50℃∼65℃에서 진행.
② 30sec～1min.
③ 염기 간의 결합은 G, C의경우 세군데 에서 수소결합이 일어나고 A, T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G+C 비율에 따라 결합 온도 결정.
④ Primer design시에 Annealing temperature를 고려해야 함.
⑤ 일반적으로 GC content가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직.
2.1.3. Step 3 : extension
① 70℃∼74℃에서 시행. (보통 TM으로 사용)
② 1min～1min 30sec.
③ Taq DNA polymerase의 합성 속도: 2,000∼4,000 nucleotides/min, 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당.

참고 자료

실험생화학 개정 3판, 탐구당, 한국 생화학 저, 1999
생화학실험(2) 실험교본, 연세대 생화학과.
Stryer Biochemistry 6th Ed, Freeman.