Bradford Assay (Protein 정량)

소개

생명과학실험 레폿 A+받은 자료입니다~

목차

Ⅰ.실험 제목

Ⅱ.실험 목적

Ⅲ.원리
(1) Bradford assay
(2) 5X sample buffer의 각 조성의 역할
(3) BSA Protein (Bovine serum albumin
(4) Bradford 시약

Ⅳ.실험재료

Ⅴ.실험방법

Ⅶ.토론
(1)실험 시 특이사항 및 오차분석
(2)R2와 Blank의 의미
(3)Standard BSA 양(㎍)의 의미

Ⅷ.참고문헌

본문내용

Bradford Assay (Protein 정량)

Ⅱ.실험 목적
미리 농도를 알고 있는 Standard 용액을 이용하여 농도를 모르는 sample의 농도를 구할 수 있다.

Ⅲ.원리
(1) Bradford assay
Bradford Method는 단백질에 발색제를 가하여 가시광선 영역의 흡광도를 측정하는 정량법이다. 산성용액에서 Coomassie Brilliant Blue 염료는 단백질과 결합하게 되고, 이로 인해 염료의 최대 흡광도는 465에서 595로 이동하게 된다. 따라서, 595에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하므로 정량이 가능하게 된다.
① 장점 : 반응이 쉽고 간편하다. 발색이 신속하게 발생한다. 안정적이다.
② 단점 : detect 할 수 있는 한계는 20㎍cm-3protein이다. 용액 내 염기성 아미노산 (Arg, Lys, Tyr, Phe, his)의 content에 따라 염료가 단백질에 결합하는 정 도가 달라진다. 그러므로 기준값을 무엇으로 해야 할지가 어렵다. 많은 단 백질은 산성 용액에서 구조가 잘 풀리지 않는다.
(2) 5X sample buffer의 각 조성의 역할
① 250 Tris-HCl (pH 6.8)
최종 pH조절에 사용된다.
② 10% SDS
단백질의 전체 표면을 (-)charge로 coating하는 역할을 하기 때문에 다양한 charge를 띠는 단백질들을 한쪽 방향으로만 전기영동 시킬 수 있도록 하여 오직 size로만 분리되도록 하는 SDS-PAGE에서 가장 핵심적인 역할을 담당한다 할 수 있다.
③ 30% Glycerol
Glycerol은 침강제로서 무겁기 때문에 Protein solution과 섞어주면 같이 무거워 져서 잘 가라앉게 된다. 전기영동 젤의 콤이 있는 자리에 놓을 때 잘 가라앉으라고 함께 섞어준다.

참고자료

· 2013.03.30, http://proteomics.dynalias.org/reference/histo.html
· 2013.03.30, http://biotechnology.tistory.com/34
· 2013.03.30, http://www.nature.com/protocolexchange/system/uploads/1330/ori ginal/fig%201mod.JPG
· 2013.03.30, http://www.medicine.mcgill.ca/physio/vlab/otherexps/endo/spectro .htm