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쥐 생식기관 해부

Ⅰ.실험 제목쥐의 생식기관 해부Ⅱ.실험 목적생쥐의 비뇨생식기를 외관상 관찰과 해부상 관찰을 통해 척추동물의 비뇨생식기계 구조를 파악하고 그 기능을 이해한다.Ⅲ.원리분류학적으로 척추동물문(vertebrata), 포유동물강(mammalia), 쥐목(rodentia), 쥐과(muridae)에 속한다. 종수는 220속으로 약 1,800여종이 있으며 야행성이고 잡식성이다. 임신기간이 짧고, 출산횟수나 한배에 낳는 새끼의 수가 많다. 쥐를 실험동물로 많이 사용하는 이유는 생물학적으로 인간과 유사(척추동물)하고 실험 결과가 잘 나타나기 때문이다. 또한 유전자 조작이 쉽고 비용이 적게 소요되며 대량 사육이 가능하고 세대가 짧아 실험동물로 적합하다.생명체를 다루는 실험이므로 해부실험 중에 장난을 하거나 함부로 다루지 않으며 생명에 대한 존엄성을 상기해야한다. 또한 동물을 치사(희생)시킬 때는 안락사를 시켜 고통을 주어선 안 되고 실험 후에 뒤처리를 깔끔하게 해야 한다.안락사의 방법에는 경추탈골(cervical dislocation)법이 있다. mouse의 꼬리를 오른손으로 잡고 왼손으로 엄지와 검지를 이용하여 mouse의 등 쪽 척추를 따라 가볍게 문지르듯 머리 쪽으로 올라가며 경추 주위에서 눌러 머리를 바닥에 고정시킨다. 머리 고정과 동시에 왼손의 꼬리를 잡아 빼면 된다.Ⅳ.실험재료실험용 암수 mouse, 장갑, 해부기구(dissecting table, 해부가위, 핀셋), 70% 알코올, 거즈, 마스크Ⅴ.실험방법① mouse를 경추탈골(cervical dislocation)을 통해 안락사 시킨다.?주의사항-청결한 실험을 위해 마스크와 장갑을 꼭 착용하고 머리를 묶는다.② mouse의 배가 위를 향하게 해부 접시 위에 올려놓은 후 털이 날리는 것을 방지하기 위해 알코올로 충분히 적시고 외부생식기를 관찰한다.③ 핀셋으로 뒷다리 사이의 복부 표피를 잡고, 해부가위로 피부를 가로로 1~2cm 가량 자른 후 손으로 쥐의 가죽을 끝까지 잘 절개한다.④ 핀셋과 해부가위를 이용하여 복막을 절개한다.⑤ 장을 걷어낸 뒤 암컷과 수컷의 비뇨생식기계를 꺼내고 관찰한다.Ⅵ.결과(1)외부생식기 관찰(1)male reproductive organs(2)female reproductive organsⅦ.토론(1) 암컷, 수컷 쥐의 생식기 관찰하고 그리기①소화관을 꺼내면 내부 생식기가 보인다.②수컷은 음낭 위를 핀셋으로 끌어내면 흰빛에 붉은 무늬가 있는 정집이 나온다.③암컷은 콩팥의 뒤쪽에 알집이 붙어있다. 수란관은 가늘고 꼬불꼬불하다.(2)수컷의 생식기는 정소, 정소상체, 정관, 정낭, 응고선, 전립선, 요도구선, 포피선, 음경 등으로 되어있다. 정낭 내에는 정자가 존재하지 않으며, 정낭 내측에 부착되어 있는 응고선으로부터의 분비물은 교미 후에 질내에서 정낭의 분비물을 응고시켜 질전(vaginal plug)을 형성한다.암컷의 생식기는 난소, 난관, 자궁, 질 및 음핵선 등으로 되어있다. 마우스의 자궁은 중복자궁으로 1쌍이 존재한다. 암컷은 경흉부에 세 쌍, 서혜복강부에 두 쌍 등 5 쌍의 유선을 갖고 있다.

자연과학| 2014.07.09| 4페이지| 2,000원| 조회(4,233)

쥐, mouse, 쥐 해부, 쥐 생식기관, 생식기관 해부

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배아의 전후축 및 등배축 형성 분석, 내부 비뇨생식기계 및 순환계 관찰

Ⅰ.실험 제목Xenopus laevis 배아의 전-후 축 및 등-배 축 형성 분석과 내부 비뇨생식기계 관찰Ⅱ.실험 목적Xenopus laevis 배아의 초기 발생 과정을 관찰하고, 척추동물 배아의 전-후 및 등-배 축 형성에 LiCl과 SU5402가 미치는 영향을 분석한다. 또한 Xenopus laevis의 암컷과 수컷의 내부 비뇨생식기계를 관찰한다.Ⅲ.원리척추동물의 전-후 축(anterior-posterior body axis)과 등-배 축(dosal-ventral body axis)은 배아 발생 초기에 결정된다.아프리카 원산 무미 양서류의 일종인 Xenopus laevis는 다른 양서류에 비해 실험 재료로서 몇 가지 장점을 지니고 있어 현재의 양서류 발생학 연구재료로 많이 사용되고 있다. 장점에는 난자를 계절과 무관하게 쉽게 구할 수 있고 실험실에서의 성체 사육이 가능하다는 점이 있다. 또한 발생 속도가 빠르고 외부의 충격에 대한 저항성이 우수하다.양서류의 난자의 동물극-식물극 축은 배아의 전-후 축을 결정하므로 전-후 축은 이미 난자에 존재하고 있다고 생각된다. 난자와 정자가 융합한 후에 수정난의 세포질이 재배열되어 배-복 축이 형성된다. 낭배 운동은 배의 근본 형태와 발생의 방향을 결정짓는 가장 중요한 형태형성 운동으로 그 결과 3배엽(내배엽, 중배엽)의 형성과 함께 3가지의 축을 중심으로 한 형태가 구체적으로 나타난다.Xenopus laevis 배아에서는 난자형성 과정 동안 일어나는 변화와 수정과정의 정자 유입이 체 축 형성에 중요한 역할을 한다. 그 과정은 이후의 신호전달물질들의 작용과 함께 체 축을 결정하게 된다. 본 실험에서는 LiCl와 SU5402가 양서류 초기 배아의 체 축 형성에 미치는 영향을 분석한다.① LiCl가 전-후 축 형성에 미치는 영향Wnt 신호전달계의 GSK-3 활성을 억제함으로서 원구배순부가 함입되지 않고 바깥쪽으로 나오는 외낭배 운동(exogastrulation)이 일어난다. 그 결과 척색이나 중배엽성 조직으로의 분화가 일어R) 활성 저해제이다. 수정 후 stage 10.5까지 FGF신호를 차단하면 배 부위가 눈에 띠게 팽창되며 초기 내배엽의 형성도가 증가한다. 그러나 stage 10.5이후에 FGF신호를 차단하면 배 부위가 정상적인 모양을 띠고 초기 내배엽의 형성도의 증가를 관찰 할 수 없으며, 신경 조직의 불완전한 형성이 관찰된다.Ⅳ.실험재료① 실험시약Female and male Xenopus laevis,1000unit/ml Human chorionic gonadotrophin(hCG)10X Marc's Modified Ringer's(MMR)MaterialsConcentrationHEPES (pH 7.4)50mMNaCl1MKCl20mMCaCl220mMMgCl210mM3% Cysteine in 0.1X MMR (10N NaOH로 pH7.6~8.0으로 맞추고 사용직전 만듬.)1M Lithium Chloride(LiCl) in 0.1X MMRDimethyl sulfoxide(DMSO)50mM SU5402 in DMSO② 실험기구Incubator, 실체현미경, homogenizer, 해부기구(해부접시, 해부가위, 핀셋), spuit, Pipetman, beaker, Petri dish, 12well, 네임펜Ⅴ.실험방법① 수컷 Xenopus과 암컷 Xenopus에 과량의 마취약을 주사하여 안락사 시킨다.② 탈지면을 겹쳐 둔 해부접시에 수컷과 암컷 Xenopus을 올려두고 해부가위와 핀셋을 이용하여 Xenopus를 해부한다.?주의사항-혈관을 자르면 많은 양의 피가 나와 관찰에 방해가 되므로 자르지 않도록 주의한다.③ 수컷 Xenopus에서 testis를 추출하고 암컷 Xenopus의 내부 비뇨생식기를 관찰한다.① 실험 전날 암컷 Xenopus의 dorsal lymph sac에 600~800 unit의 hCG를 주사한다.?특이사항-실험상의 편의를 위하여 전날 조교언니가 준비해주셨다.② Petri dish에 egg를 짜서 받는다.?주의사항-힘을 준 듯 안 준 듯 잡아야 개구리가 받는 스은 후, homogenizer로 으깬다.⑤ Testis 현탁액을 pipetman으로 embryo에 여러 번으로 나누어 뿌려준다.⑥ 상온에서 5분간 둔 후, petri dish에 0.1X MMR을 채워 상온에 둔다.① 수정 시작 후 15분이 지나면 MMR을 버리고, 3% Cysteine/0.1X MMR을 부어 천천 히 흔들며 수정란이 petri dish 바닥에서 떨어지면, 새 beaker로 알들을 옮겨 담아 천천히 흔들어 dejelly한다.② 새로운 Cysteine으로 한 번 정도 갈아준다.?주의사항-dejelly 과정은 5분이 넘지 않도록 한다.③ 0.1X MMR로 3번 정도 wash한다.?주의사항-dejelly 후 수정란이 공기에 접촉하지 않도록 주의한다.④ 12well의 위쪽 8칸에 모두 0.1X MMR을 1ml분주하고 각 well에 spuit를 이용하여 수정란을 6개씩 넣은 후, 각 조건에 맞게 labeling한다.⑤ 32-cell stage embryo를 다음과 같이 LiCl으로 30분간 처리한다.LiCl 처리 안함control(CTL)50mMLiCl 50mu l100mMLiCl 100mu l150mMLiCl 150mu l?특이사항-LiCl Stock은 1M-넣어주는 LiCl의 양 계산은 다음과 같이 MV=M'V‘(묽힘공식)을 이용한다.만들고자 하는 LiCl의 농도(M) TIMES 1 mu l=1M TIMES x mu l-32-cell stage(St.6)는 수정이 되고 약 2시간 50분 후이다.⑥ 0.1X MMR로 wash하고 0.1X MMR에 보관한다.⑦ embryo에 다음과 같이 SU5402로 하루 동안 처리한다.1%DMSO 10mu l25mu MSU5402 2.5mu l50mu MSU5402 5mu l100mu MSU5402 10mu l?특이사항-SU5402 Stock은 10mM-넣어주는 SU5402의 양 계산은 다음과 같이 MV=M'V‘(묽힘공식)을 이용한다.만들고자 하는 SU5402의 농도(M) TIMES 1 mu l=1M TIMES x mu DAI를 참고하여 0-11단계로 나누어 구분하고 LiCl과 SU5402 처리와의 관계를 분석한다.DAI (Dorso-Anterior Index)DAI 0: most ventralized, DAI 5: normal, DAI 11: most dorsalizedⅥ.결과(1)유생의 전-후 축 및 등-배 축 형성 정도control(CTL)LiCl 처리50mM100mM150mMSU5402 처리DMSO 1%25mu M50mu M100mu MⅦ.토론(1)유생의 전-후 축 및 등-배 축 형성 정도와 LiCl과 SU5402 처리와의 관계 분석다음은 결과를 바탕으로 DAI를 참고하여 각 조건에서의 단계를 구분한 표이다.controlLiCl 처리SU5402 처리50mM100mM150mMDMSO 1%25mu M50mu M100mu MDAI 5DAI 6DAI 8DAI 5DAI 7DAI 0대조군으로 설정했던 control은 DAI 5으로 정상을 나타내었다.LiCl을 처리했을 때는 처리한 농도가 높을수록 dorsalization(머리는 있으나 몸이 짧은 상태)된 경향을 보이고 있다. 그런데 유독 LiCl을 150mM 넣은 것에서는 발생과정이 전혀 진행되지 않았는데 그 이유는 너무 심한 외부 충격(높은 LiCl 농도)로 인해 배아가 파괴되었거나 발생이 느리게 진행되는 것으로 생각할 수 있다.SU5402 처리 조건에서 DMSO만을 1% 넣은 것에서는 DAI 5으로 정상을 나타낸 반면, SU5402을 넣은 것들은 정상적으로 발생이 진행되지 않았다. 이것으로 보아 배아의 발생은 DMSO가 아닌 SU5402의 영향을 받는다는 것을 알 수 있다.SU5402에 대해 사전 조사해보았을 때, 이것은 ventralization(머리의 발달이 제대로 일어나지 않은 상태)을 유도하는 시약이다. 그러나 SU5402를 25mu M 넣은 것에서 배아의 눈이 관찰되었다. 즉, DAI 7단계에 가깝다. 이것은 실험 과정 중에 오류가 있었음 의미하는데 가장 강력한 오류는 well에 알맞은 양의 시약을 넣는 과정에 있다서는 처음부터 각 well에 1ml의 MMR을 넣어 놓고 시약을 넣는 방법으로 제조를 하다 보니 결국 처음 설정했던 조건과 달라져버렸다. 또한 암컷 Xenopus으로 부터 얻은 egg가 워낙 적은 양이어서 많은 양의 egg로 실험을 하지 못했기 때문에 이 실험결과의 정확도와 정밀도가 떨어졌다고 생각한다. SU5402를 50mu M 넣은 것에서는 DAI 0으로서 ventralization된 결과가 나왔다. 이것으로 보아 SU5402가 ventralizated를 유도한다는 것을 더 확실히 알 수 있다. SU5402를 100mu M 넣은 것에서 발생이 진행되지 않은 것은 LiCl을 150mM 넣었을 때와 마찬가지로 너무 심한 외부 충격(높은 SU5402 농도)로 인해 배아가 파괴되었거나 발생이 느리게 진행되는 것으로 생각된다.이번 실험에서는 단지 LiCl과 SU5402의 양만을 달리하고 시간의 조건을 주지 않았기 때문에 발생 시기에 따른 시약의 영향은 알 수 없다. 하지만 Xenopus의 발생과정 중 가장 먼저 형성되는 기관이 신경관과 척삭이기 때문에 발생 초기에 LiCl에 노출되는 것은 매우 치명적이라는 것을 유추 할 수 있다.(2)Xenopus laevis의 구조와 현상양서류의 수정란의 동물반구와 식물반구는 색깔이 다르다. 동물반구는 진한 회색을 띠는데, 이는 검은색의 멜라닌 과립이 이 지역에 있는 세포들의 외부층인 피층에 들어있기 때문이다. 식물반구에는 멜라닌이 없고, 대신에 난황이 있어 노란색을 띠게 된다.①Cortical rotation원형질막과 연관 피층이 내부 쪽 세포질에 대해 회전하는 피층회전(cortical rotation)이 일어난다. 정자는 항상 동물극 쪽으로 진입하며 동물반구 쪽 피층은 정자핵이 진입한 쪽에서 식물극 내부 세포질 쪽으로 움직인다. 정자 진입부 반대쪽의 식물극 피층은 동물극의 내부 세포질 쪽으로 움직인다. 피층회전으로 인해 정자가 들어온 반대 지점의 식물반구 피층에 있는 분자들이 동물반구의 내부 세포질에 있는 분자들과 상호작용하여

자연과학| 2014.07.09| 6페이지| 2,000원| 조회(451)

개구리, Xenopus laevis, 배아의 전후축

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p63에 의한 세포 사멸 분석

Ⅰ.실험 제목단백질 확인 및 세포사멸 분석하기Ⅱ.실험 목적p53이 없는 체세포에 손상을 주었을 때 p63에 의한 세포 사멸이 일어나는지 확인하고 세포 사멸 기작을 이해한다.Ⅲ.원리(1) DNA damage responseIR, UV, Chemical reagent에 의해 DNA가 손상을 받으면 MRN complex(Mre11, Rad50 and Nbs1)가 DNA break를 인식한다. 그러면 ATM/ATR등의 kinase가 DNA를 인산화 시켜 p53과 같은 transcription factor들이 작동하기 시작한다. 세포가 약한 손상을 입었을 경우엔 손상이 복구될 때까지 세포주기를 억제시키면 된다. 그러나 강한 손상을 입었다면 돌연변이나 염색체 이상을 일으켜 암을 유발할 수 있기 때문에 세포 사멸이 이루어 져야한다.대표적인 transcription factor인 p53은 DNA의 손상으로 활성화되는 단백질로서 세포주기가 멈추면 DNA 복구에 필요한 유전자들을 발현시킨다. 만약 DNA 손상을 복구할 수 없을 경우, p53 단백질은 자살유전자를 발현시켜 세포 사멸(apoptosis)을 일으킨다. 이러한 방식으로 p53은 DNA 손상으로 인해 돌연변이를 지닌 세포의 분열을 방지한다. 따라서 p53을 발현시키는 유전자가 제대로 기능을 하지 못하게 되면, 돌연변이가 축적된 세포가 생존하여 계속 분열하게 되고 결국 암으로 진행된다.(2) TAp63alpha TAp63alpha 는 p53 유전자와 homologue인 p63의 6가지 isoform 중 하나로서, 여성 생식세포에서 과하게 발현되어 있다. 또한 DNA가 손상되었을 때 난모세포의 사멸을 유도하는 역할을 한다.(3) Fetal Bovine Serum세포 및 조직배양에서 많이 사용되는 혈청으로서 growth factor, protein을 공급하여 세포 증식에 도움을 준다.(4) Gene transfectionDNA를 세포 내에 주입하여 발현되도록 하는 것이다. Chemical method에는 calcium-pho한 media를 pipette을 이용하여 e-tube에 담고 centrifuge를 이용하여 5~6분정도 cell down한다.⑨ cell down된 e-tube에서 media를 제거하고 새로운 media를 resuspension한 뒤 plate에 배양한다.① 24~48시간 전에 plating한 Tsu-pr1 cell을 준비한다.② clean bench를 작동시킨 후 latex glove을 끼고 alcohol로 손과 clean bench안을 소독한다.?주의사항-모든 실험 용품은 alcohol로 소독한 후 clean bench안에 넣어 둔다.-팔과 손을 최대한 clean bench의 안쪽으로 깊숙이 넣고 실험을 진행한다.③ e-tube를 8개 준비한 후 각각 labeling한다.④ pipette을 이용하여 각 e-tube에 SFM, PEI, DNA를 알맞은 양 넣는다.#1#2#3#4#5#6#7#8SFM50 mu l1조PEI 0.5mu lPEI 1mu lPEI 1.5mu lPEI 2mu lDNA 5mu l2조PEI 1mu lPEI 2mu lPEI 3mu lPEI 4mu lDNA 10mu l3조PEI 2mu lPEI 4mu lPEI 6mu lPEI 8mu lDNA 20mu l?특이사항-3조이기 때문에 100ng/ lambda 의 DNA를 2mu g 넣기 위해서는{2 TIMES 10 ^{3} ng TIMES 1 lambda } over {100ng} =20 lambda =20 mu l을 넣으 면 된다.⑤ 알맞은 양을 담은 e-tube들을 짧게 spin 시켜 tube 벽면에 묻은 것들이 밑으로 잘 가라앉도록 한다.⑥ #1~#4의 e-tube 내용물을 #5~#8의 e-tube에 각각 옮겨 담고 잘 섞어준다.⑦ Incubator에 넣고 30분간 기다린다.⑧ pipette를 이용하여 각각의 e-tube의 내용물을 Tsu-pr1 cell이 있는 plate에 옮겨 담는다.① Spacer plate, Short plate을 물로 깨끗이 닦은 후 tissue로 먼지 없이 닦아낸다.②uffer를 채우고 25~30V로 120분~100 분 동안 transfer한다.?주의사항-전극의 방향이 올바르도록 주의하여 연결한다.? skim milk를 10㎖ 넣은 후 교반기에 올려두고 3분 동안 Blocking한다.?주의사항-5% milk를 30ml만들려면 1.5g을 넣으면 된다.-transfer된 단백질이 소실되지 않게 skim milk는 조심스럽게 marker 쪽으로 넣어야한다.? blocking solution을 버리고 Primary antibody(1:200)를 넣은 후 교반기에 올려두 고 1시간 동안 incubation하고 4℃에서 overnight한다.?Primary antibody는 monoclonal 4A4? Primary antibody를 버리고 0.1% PBST를 넣어 10분씩 3번 wash한다.? Secondary antibody(1:5000)를 넣은 후 교반기에 올려두고 1시간 incubation한다.?Secondary antibody는 goat anti-mouse lgG HRP? Secondary antibody를 버리고 0.1% PBST를 넣어 10분씩 3번 wash한다.? ECL detection한다.① 24well plate에2 TIMES 10 ^{4}cell/well로 다음과 같이 plating한다.② 24시간 뒤에 DNA damage reagent를 다음과 같이 처리한다.1분반2분반3분반방사선의흡수선량1조0Gy2조4.5Gy3조10Gy시간7H20H48H③ Media를 suction을 한다.④ 한 sample당 media360 mu l과0.5mg/ml MTT40 mu l을 잘 섞어 well에 분주한다.?특이사항 및 주의사항-MTT stock은5mg/ml-sample이 많기 때문에 pipetting error를 예방하기 위해 master mixture를 만들어 사용 한다. 총 9개의 sample이 있으므로 각각 9.5를 곱한 양만큼을 넣는다.따라서, media 양=360 mu l TIMES 9.5=380 mu l, MTT 양=37198평균1.04241.03900.7985Tsu-pr1-TAp63alpha#50Gy 20H4.5Gy 20H10Gy 20H0.87410.87000.84580.78610.79790.78880.49470.61560.50110.86570.85220.87370.78100.79200.80250.61470.72320.6183평균0.86990.86110.85980.78360.79500.79570.55470.66940.5597평균0.86360.79140.5946Tsu-pr1-C306R#60Gy 20H4.5Gy 20H10Gy 20H0.86930.87950.81930.71990.71990.72620.72400.57220.65540.87800.89150.86800.70390.72180.71570.50430.61670.7671평균0.87370.88550.84370.71190.72090.72100.61420.59450.7113평균0.86760.71790.6400(5)MTT Assay(Cell viability test) 결과2다음은 MTT Assay(Cell viability test) 결과1에서 평균값들을 표로 정리한 것이다.Tsu-pr1 7HTsu-pr1-TAp63 7HTsu-pr1-C306R 7H0Gy4.5Gy10Gy0Gy4.5Gy10Gy0Gy4.5Gy10Gy0.43420.55220.43500.28430.44310.37500.37520.43670.3930Tsu-pr1 20HTsu-pr1-TAp63 20HTsu-pr1-C306R 20H0Gy4.5Gy10Gy0Gy4.5Gy10Gy0Gy4.5Gy10Gy1.04241.03900.79850.86360.79140.59460.86760.71790.6400Ⅶ.토론(1)각 실험의 목적①Cell culture & Gene transfection계대 배양에 대한 이론과 실험기법을 익히고 cell을 counting하는 방법을 이해하며 transfection에 사용할 cell을 준비한다.gene transfection에 대해 이해하고 어느 조건에서 발yclonal antibody는 동물에 주입한 단백질처럼 하나의 항원에 반응한 많은 수의 다른 B림프구에 의하여 형성된다. 각각의 B 림프구 무리의 세포들은 각각 다른 항원결정 부위(epitope)에 특이적으로 결합하는 항체를 생산한다. 따라서 Polyclonal antibody는 한 단백질의 다른 부분을 인지하는 항체들의 혼합물로 얻어진다.(6)실험design하기p63 Ab를 이용하여 각 cell line마다 p63 발현을 확인하고자 한다.①Primary antibody로 ULBP4 Antibody (6E6) mouse monoclonal을 사용한다.②Secondary antibody로 Rabbit Anti-Mouse IgG H&L (HRP)(ab97046)사용한다.③immunoblot or immune stain을 통해 발현을 확인한다.(7)PEI와 DNA 농도에 따른 western blotting 결과 분석1조, 2조, 3조의 PEI와 DNA 농도에 따른 western blotting 결과를 비교했을 때 2조의 band가 가장 깔끔하게 잘 나타났다. 따라서 DNA양은 10mu l일 때가 가장 적당하다는 것을 알 수 있다. 2조의 #2~#5를 비교했을 때 #3의 band가 가장 선명하면서 적당한 두께로 분포되어있다. 따라서 PEI양은 2mu l일 때가 가장 적당하다는 것을 알 수 있다.2조의 #6와 #7를 비교했을 때 #7에는 100ng로 많은 양의 TAp63alpha (transcription factor)을 넣어주었을 뿐만 아니라 293T가 p53을 가지고 있는 cell이기 때문에 단백질이 굉장히 많이 발현되어 band의 두께가 두껍게 퍼져서 나타난 것으로 생각할 수 있다. #8과 #9를 비교했을 때 #8에는 DNA 손상을 주지 않았기 때문에 단백질이 발현되면 안 되는데 두 band가 모두 선명하게 나타난 것으로 보아 DNA 손상에 상관없이 발현되는 단백질이 존재하거나 실험과정 중에 실수로 DNA 손상이 일어났다고 생각 할 수 있다.(8)MTT Assa 있다.

자연과학| 2014.07.09| 13페이지| 2,000원| 조회(131)

apoptosis, 세포사멸, p63

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Functional Analysis of Lymphocytes

Ⅰ.실험 제목Functional analysis of lymphocytes by ELISAⅡ.실험 목적분리한 T lymphocytes와 B lymphocytes의 활성을 유도하고 분비된 cytokine 또는 antibody를 이용하여 특이적인 antigen-antibody 반응을 분석한다.Ⅲ.이론적 배경(1)Activation methods for T and B lymphocytes후천성 면역은 체액성 면역반응과 세포성 면역반응에 근거를 둔다. 체액성 면역반응(homoral immune response)은 antibody가 중요한 역할을 하기에 항체매개반응이라고도 한다. 세포성 면역반응(cell-mediated immune response)은 표적세포를 찾아내어 파괴하는 세포독성 T cell의 활성화 및 클론선택 과정이다. 림프구의 세 번째 림프구 집단인 helper T cell은 상기 두 면역반응 과정을 돕는다. 항원제시세포가 세균을 섭취하여 분해한 후에, Ⅱ형 MHC와 결합된 세균 항원조각을 그 표면에 전시한다. 특이적인 helper T cell은 CD4 분자의 도움을 받아 TCR을 통하여 전시되어 있는 복합체를 인식한다. 이러한 상호결합은 항원제시세포로부터 cytokine을 분비하도록 한다. 항원제시세포와 helper T cell 자체에서 분비된 cytokine에 의해 T cell이 증식하고 활성화된 helper T cell 클론으로 분화한다. 활성화 helper T cell은 MHC-항원 복합체에 대해 모두 같은 수용체를 가지고 있다. 활성화된 세포독성 T cell은 CD8 분자의 도움으로 TCR을 통하여 표적세포의 Ⅰ형 MHC-항원 복합체에 결합한다. T cell은 표적세포의 세포막에 구멍을 내는 퍼포린 분자와 가수분해효소인 그랜자임을 분비한다. 그랜자임은 세포내 섭취작용을 통하여 표적세포 내로 들어간다. 그랜자임은 표적세포 내에서 apoptosis를 유도하여, 핵과 세포질을 조각내어 세포를 죽인다. 세포독성 T cell은 떨어져 나와 다른 표적세포를대신에 항원 특이 항체를 플라스틱에 결합시키는 방법이다. 따라서 이들은 항원에 높은 친화력으로 결합하고, 처음 반응물에는 낮은 농도로 존재하던 항원을 반응용기 내에서 농축시키는 효과가 있다. 처음 이용된 항체와는 다른 epitope를 인식하는 표지된 항체를 이용하여 결합한 항원을 확인한다.이 방법을 이용하여 실험을 할 때엔 분석방법을 표준화하기 위해, 항원이나 항체 가운데 한 가지 또는 두 가지 모두가 정제된 상태로 필요하다. 항체에 효소를 화학적으로 결합시켜 표지되지 않은 항원에 결합하고, 결합하지 않은 항체 및 다른 단백질은 washing을 통해 제가한다. 결합한 항체의 양은 무색의 기질을 유색의 반응물질로 바꾸는 효소반응으로 측정된다. 반응 색의 변화는 반응 용기 내에서 직접적으로 판독이 가능하여 결과 정리를 간단하게 하고, 효소를 이용하므로 방사선 물질의 사용을 피할 수 있다. 이러한 이유로 ELISA가 가장 많이 사용되고 있다.Ⅳ.실험재료Cell line : WEHI 231 (naive mouse B cell)Cell stimulation : media control, LPS,alpha -CD40 + IL-4T dependent antigen mjection 7일째 serum, 42일에 boosting한 47일째 serumPBS control, BSA, IgM, lgG, PBST, Biotin, streptavidin-HRP, OPD, stop solutionpipette, incubator, e-tube, 96well, shaker, microtube, voltaxing기, multi-channel micro pipette, UV spectrophotometer, centrifugal separator, 알루미늄 호일Ⅴ.실험방법① total2 TIMES 10 ^{6} cell을 1000rpm에서 3분간 cell down한다.② media1ml에 cell pellet을 resuspend하고 각 well당100 lambda 씩 seeding한다.③ LP 37℃에서 48시간 incubation하고 supernatant collection후 -80℃에서 보관한다.① capture antibody(IgM or IgG)를100 lambda 씩 45분간 well에 coating한다.② PBST를 통해 1번 washing한다.③ 3% BSA200 lambda 를 well에 넣고 45분간 blocking한다.④ Standard를 준비한다.?준비과정-e-tube 7개에 각각 ST1~ST7로 labeling한다.-ST1~ST7에 각각 3% BSA를360 lambda 씩 넣고 ST1에 standard solution을120 lambda 넣고 잘resuspend한다. (standard solution-250ng/ml)-ST1 solution120 lambda 을 ST2 e-tube에 넣고 resuspend한 후 같은 과정을 반복하여 ST7 solution까지 만든다. (1/4로 희석)-만든 ST1~ST7 solution을 각 well당100 lambda 씩 3개의 well에 각각 넣는다.-끝에 well엔 3% BSA100 lambda 씩만 넣은 BLANK를 만든다.⑤ Sample을 준비한다.?준비과정-in vitro sample에서는 B cell activation실험에서 준비한 control, LPS, CD40+IL-4를 IgM인 경우엔6 lambda `:`120 lambda (BSA)로, IgG인 경우엔30 lambda ``:``120 lambda (BSA)로 희석한다.-in vivo sample에서는 PBS control, T dependent antigen mjection 7일째 serum,T dependent antigen mjection 42일에 boosting한 47일째 serum을 IgM, IgG인 경우 둘 다4 lambda `:``400 lambda `(BSA)로 희석한다.-각각 희석한 sample을 각 well에100 lambda 씩 넣는다.⑥ 45분간 incubation 한 후 PBST로 3번 washingSDCVDilutionAdjConcmediacontrolA101.26258.89571.82224.21833.7201436.449A111.25456.811A121.36499.761LPSB101.12131.64232.9392.1686.620658.789B111.14835.442B121.12231.734CD40+IL-4C101.12832.63536.219.72526.920724.207C111.09828.779C121.21447.217PBS controlD100.1840.5580.5410.0295.410000054098.65D110.1840.558D120.1710.507T dependent Ag -7일째E100.4152.031.9540.0683.5100000195430E110.4051.935E120.4011.898T dependent Ag boostingF100.96817.41215.5642.44515.7*************F110.95416.488F120.88512.791(2)IgG를 이용한 실험결과SampleWellsODConcAvgConcSDCVDilutionAdjConcmediacontrolA40.7021.9271.9180.0341.847.67A50.6931.88A60.7051.946LPSB40.641.6271.5960.0412.546.382B50.6371.611B60.6231.55CD40+IL-4C40.6361.6071.5540.062446.217C50.6081.485C60.6281.57PBS controlD41.0164.4564.6090.2124.6100000460916.1D51.0484.852D61.0224.52T dependent Ag -7일째E41.1626.7296.8340.2774.1100000683387.8E51.1827.148E61.1576.624T dependent Ag boostingF41.40515.61417.1372.71115.8*************F51.40415.529F61.46320.267Ⅶ.토론IgM을 이용한 실험결과와 Ig 중에 OD값이 1보다 큰 데이터가 그에 해당한다고 볼 수 있는데 그것은 농도가 진해 희석시켜야함을 의미한다. 네 번째로는 well plate 밑면을 손으로 만진 경우를 들 수 있다. OD를 측정할 때 well plate의 밑면으로 빛을 통과시키기 때문에 밑면이 손에 닿아 이물질이 묻어있다면 정확한 OD값이 측정되지 못했을 것이다. 다섯 번째로는 실험 강의의 한계 때문에 충분한 incubation이 이뤄지지 못한 경우를 생각해 볼 수 있다. 학부생을 위한 실험 강의에서는 여러 사람이 함께 실험을 하기 때문에 분위기의 영향을 받을 확률이 높다. 옆의 조원이 실험을 진행하는 속도가 빠르다보니 나도 그 속도에 영향을 받아 incubation시간을 제대로 지키지 못했다. 이러한 이유들로 측정된 IgM의 standard curve는 정확성과 정밀성이 현저히 떨어져 실험 데이터로의 가치가 없다고 볼 수 있다. 따라서 standard curve를 바탕으로 계산된 antibody농도도 신뢰할 수 없는 데이터이다. IgG의 standard curve는 비교적 잘 측정되었고 R2값도 0.998이상이므로 실험 데이터로서의 가치가 있다고 볼 수 있다. 따라서 standard curve를 바탕으로 계산된 antibody농도도 비교적 신뢰할 수 있는 데이터이다. 하지만 이 실험에 있어서 중요한 CD40+IL-4와 T dependent Ag boosting 데이터가 제대로 나오지 않았기 매문에 본 레포트에서는 조교님의 실험 데이터를 가지고 분석할 것이다.IgM(조교님 데이터)SampleOD 평균AdjConcmediacontrol0.735220.859LPS0.815492.101CD40+IL-40.767291.416PBS control0.18383151.29T dependentAg -7일째0.271135771.3T dependentAg boosting0.378213586.2IgG(조교님 데이터)SampleOD평균AdjConcmediacontrol0.0622.971LPS0.0150.509CD

자연과학| 2014.07.09| 7페이지| 2,000원| 조회(110)

림프구, lymphocytes, functional analysis

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Drosophila의 초기 발생과정의 분자적 조절 기작 이해

Ⅰ.실험 제목Drosophila melanogaster (초파리)의 초기 발생과정의 분자적 조절 기작 이해Ⅱ.실험 목적초기 발생 단계에 관여하는 유전자의 발현 양상을 살펴보고 초파리의 초기 발생에 대한 분자적인 특징을 이해한다.Ⅲ.원리초파리는 동물 발생에 대한 분자적 기작을 이해하는 연구의 중요한 모델 생명체로 사용되고 있다. 많은 유전자 돌연변이가 존재하고 이를 이용한 유전자 기능 연구가 가능하다. 초파리는 알, 유충(1령, 2령, 3령), 번데기, 성체 과정의 생활사를 갖는 완전변태 곤충이다. 수정된 알은 25℃에서 하루 만에 배아 단계를 지나 유충으로 깨어난다.초파리의 초기 발생은 분자유전학적으로 매우 잘 규명되어 있다. 수정 전에 이미 전후 및 배복 측이 결정되며, 수정 후에 체절이 만들어지고, 각 체절로부터 특징적인 구조들이 형성된다. 초파리의 초기 발생에 대해 관여하는 유전자는 축 형성 유전자 → 체절형성 유전자 → 정체성(구조)형성 유전자의 순서로 작용한다. 본 실험에서는 Kruppel(Kr), fushi tarazu(ftz), wingless(wg), Ultrabithorax(Ubx) 각 유전자 발현 조절 부위에 영향을 받아 lacZ 유전자가 발현되는 형질전환 초파리 배아의 X-gal(lacZ의 기질) 염색을 통하여, 각 유전자의 발현 양상을 비교할 것이다.Ⅳ.실험재료Kr-lacZ, ftz-lacZ, wg-lacZ, Ubx-lacZ 형질전환 초파리, 4% paraformaldehyde, heptane, PT, 50% glycerol, X-gal staining buffer, X-gal stock solution, 항원-항체 반응을 이용하여 염색한 형질전환 초파리 배아광학현미경, 알 수집통, chorion 및 vitelline membrane 제거용 세트, 붓, 파이펫Ⅴ.실험방법① Egg collection plate에 물을 넣고 붓으로 살살 쓸어 배아를 떼어낸 후, 천으로 밑을 막은 플라스틱 용기에 배아를 넣고, 파스테르 파이펫으로 배아를 잘 씻어 효모를 제 거한다.② 플라스틱 용기를 Falcon dish 위에 올려놓고, 파스테르 파이펫을 이용하여 용기 속 으로 50% 락스를 넣어 3~5분간 chorion을 녹여 없앤다.③ PT용액으로 배아를 여러 번 씻어 준다.④ 배아를 PT용액과 함께 유리 vial로 옮긴다.⑤ PT용액을 제거하고, 1ml 4% paraformaldehyde와 1ml heptane을 넣고 20~30분 동안 흔들면서 고정시킨다.⑥ 먼저 밑 부분의 수용성인 고정액(paraformaldehyde)를 파스테르 파이펫으로 제거하 고, heptane과 함께 배아를 1ml 튜브로 옮긴다.⑦ heptane을 제거한 후, tube를 열어 휴지 위에서 두고 완전히 말린다. (약 15~30초)⑧ X-gal staining buffer를 200mu l넣고 10분간 pre-staining한 후, 여기에 X-gal stock solution을 최종 농도가 0.25%가 되도록 넣는다. tube를 호일을 싼 채, 37℃ 에서 반응 시킨다. (약 1~2시간)?특이사항-2% X-gal stock solution을 30mu l넣었다.⑨ 염색이 확인되면 PT용액으로 염색 반응을 중지한다.⑩ 배아를 슬라이드글라스 위에 올려놓고 광학현미경으로 관찰한다.⑪ 관찰이 끝나고 나면 25%, 50%, 75%, 100% ethanol 순으로 dehydration한다.⑫ 배아를 50% glycerol에 넣어 보관한다.Ⅵ.결과(1) 유전자 발현 양상Kruppel(Kr)fushi tarazu(ftz)wingless(wg)Ultrabithorax(Ubx)Ⅶ.토론(1)각 유전자가 발현되는 발생 단계①Kruppel(Kr)Kruppel은 초파리의 체절형성 유전자(segmentation gene)중 하나이다. 체절형성 유전자는 앞-뒤축을 따라 초기 배아를 반복적인 구조인 체절원기로 나누어 놓는다. 체절형성 유전자는 돌연변이의 표현형에 기초하여 세 종류로 구분한다. Kruppel유전자는 간극유전자로 분류되며 초파리 배아의 중앙부인 4~6번 부체절에서 발현된다. Kruppel 단백질이 없는 배아는 이들 부체절과 그 인접 영역이 결여된다. 사진에서도 배아의 중앙부가 염색된 모습을 관찰할 수 있다.②fushi tarazu(ftz)체절형성 유전자 중 하나이고, 쌍지배유전자에 해당한다. 2차 쌍지배유전자 중의 하나가 fushi-tarazu이다. 14번째 분열 초기에 ftz mRNA와 단백질은 배아의 체절화된 부위 전체에서 관찰되지만, 곧이어 ftz의 발현은 1차 쌍지배유전자의 상호작용으로 인하여 일부 띠의 핵에서 발현이 억제되어 줄무늬 모양을 띠게 된다. 8개로 알려진 쌍지배유전자는 모두 줄무늬 형태로 발현하지만 이들 형태가 서로 일치하는 것은 아니다. 이 쌍지배 단백질이 다음 단계에 작용하는 체절형성 유전자인 체절극성 유전자를 활성화시키게 된다. ftz가 발현되면 7개의 줄무늬가 나타나게 되는데 왼쪽에 있는 배아의 경우에는 완전히 발현되지 않아서 줄무늬가 다 나타나지 못 한 것 같다. 나머지 두 배아는 선명하게 7개의 줄무늬가 있는 것을 볼 수 있다.③wingless(wg)체절형성 유전자인 체절극성유전자 중의 하나이다.(wg와 en이 있다.) wg와 en의 발현은 쌍지배유전자에 의해 시작된다. wg유전자는 eve와 ftz 유전자 어느 것도 발현되지 않고 세 번재 유전자 sloppy-paired가 발현될 때 발현한다. 그렇기 때문에 Eve와 Ftz 유전자 산물이 없는 그 사이에서만 wg가 발현되기 때문에 더 촘촘한 간격으로 염색이 되어 있는 것을 볼 수 있다.④Ultrabithorax(Ubx)Ultrabithorax(Ubx)는 세 번째 가슴체절의 구조를 정하는 데 필요한 정체성 형성 유전자이다. bithorax 복합체에 속해 있으며 가슴과 복부 부위를 분리시킨다. Ubx 유전자가 결핍되는 경우에는 세 번째 가슴체절은 두 번째의 가슴체절로 전환되고 그 결과로 4개의 날개를 갖게 된다. 따라서 세 번째 가슴체절의 위치에 해당하는 부위가 염색되어 있는 것을 확인할 수 있다.

자연과학| 2014.07.09| 3페이지| 2,000원| 조회(161)

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