PCR에 의한 DNA절편의 증폭

목차

1. Title
2. Date
3. Name
4. Purpose
5. Materials
6. Methods
7. Discussion.
8. Project

본문내용

4. Purpose
PCR의 원리를 이해하고 실제로 DNA의 절편을 증폭하여 본다.

5. Materials
Template DNA(colony), Taq polymerase, dNTP, primer (front, reverse), 5X reaction buffer, D.W, PCR machine, micropipette, microtube

6. Methods ① DNA 및 다른 시료들을 아래 표의 농도로 준비한다.
② 시료들은 DW, buffer, DNA, Taq polymerase 순으로 섞는다.
③ 아래의 반응 조건에서 PCR을 수행한다

7. Discussion.
이 실험의 목적은 PCR의 원리를 이해하고 실제로 DNA의 절편을 증폭하는 것이다.
이 실험에서 사용한 DNA sample은 아메바의 DNA이다. 실험에서 사용한 시료들은 자기들끼리의 반응을 방지하기위해 낮은 온도에 보관된 상태로 제공되었다. 이번 실험은 조교님이 준비해주신 PCR에 필요한 시료들을 단지 micropipett을 사용하여 microtube에 넣어 섞기만 하는 어렵지 않은 실험이었다. 시료에는 primer와 dNTPs 그리고 Taq polymerase가 있었다. 각 시료들은 PCR에서 서로 다른 기능을 한다. primer는 목적 DNA가닥에 증폭시키고 싶은 영역의 3`말단에서 시작되는 상보적인 염기배열을 인위적으로 합성한 Oligonucleotide이다. dNTPs는 nucleic acids(DNA, RNA)를 구성하는 재료이다. 그리고 dNTPs는 polymerase가 nucleic acids를 합성해 나아가는데 필요한 에너지를 제공한다. 마지막으로 Taq polymerase는 내열성 세균으로부터 정제한 내열성 DNA중합효소로 이 효소는 5`에서 3`방향으로 DNA를 합성하는 역할을 한다.
PCR은 온도에 따라 변성, 결합, 진행의 세 단계의 cycle로 구성된다. 이 실험에서는 cycle을 30회 반복한다. 변성과정은 DNA가 열변성되는 과정으로 시발체의 결합이 가능하도록 이중가닥 DNA를 한 가닥 DNA로 만드는 과정이다. 실험방법에도 나와 있듯이 95℃에서 1~2분정도 열을 가하면 base pairs간의 수소결합이 끊겨 단일가닥이 된다. 결합과정은 단일가닥으로 풀어진 주형가닥에 primer가 각각의 상보적인 sequence에 결합하는 것이다. 우리의 실험에서는 55℃에서 5초간 반응시킨다. 진행단계는 Taq polymerase에 의한 DNA의 합성단계로 Taq polymerase가 primer의 3`end의 free OH기를 시작해서 단일가닥의 상보적인 dNTP를 가져와 사슬을 신장시킨다. 보통 72℃에서 2~3분간 반응시킨다.

참고자료

· 최용락 저/ PCR 실험의 원리와 응용/ 2003/ 세종출판사