gene cloning

소개

원하는 gene을 pcr machine으로 증폭시키고, 이 증폭시킨 gene을 vector에 ligation 하여 마지막에는 이것을 competent cell에 transformation하여 clone을 만든다

목차

1.subject
2.object
3.introduction
4. material
5.method
6.result
7.discussion

본문내용

1. subject
- gene cloning

2. object
- 원하는 gene을 pcr machine으로 증폭시키고, 이 증폭시킨 gene을 vector에 ligation 하여 마지막에는 이것을 competent cell에 transformation하여 clone을 만든다.

3. Introduction
- primer design
① DNA 의 변성(denaturation) :
- 한쌍의 primer(증폭할 부분을 잡는 짧은 염기서열), dNTP(유전자를 합성하는 재료가 되는 각 뉴클레오티드 염기), 내열성 DNA polymerase(열에 특별히 강한 유전자 합성효소)를 mixture로 만들고, 90℃∼96℃로 가열하여 double strand DNA를 single strand DNA로 분리시킨다. 너무 높은경우 Tag DNA polymerase가 활성이 낮아질수 있으므로 적당한 온도에서 해야한다.

② Primer 의 결합(annealing) :
- template DNA(증폭 대상이 되는 DNA)에 primer가 결합하는 과정으로 열변성에 의해 생긴 한가닥 주형 DNA에 primer를 annealing한다. 이 과정은 주로 50℃∼65℃사이에서 일어난다. 염기 간의 결합은 G, C 결합의 경우는 세군데 에서 수소결합이 일어나고 A, T결합의 경우는 두군데에서 결합이 일어난다. 그러므로 염기 간의 결합은 G,C에의해서 많이 좌우되므로 이것의 비율에 따라서 결합 온도에 변화를 주는 것이 좋다. 일반적으로는 GC content가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 가장 바람직한 실험이다.

③ DNA의 합성(polymerization) :
-DNA polymerase에 의한 상보성 DNA를 합성하는 과정이다. 주로 70℃∼74℃에서 시행되는데 원하는 gene의 size에 따라서 온도가 결정된다. 시간은 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 연장시킬 수도 있다. Taq DNA polymerase는 보통 1분에 2,000∼4,000 nucleotides를 합성할 수 있으므로 원하는 PCR 산물의 크기 1 kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다.
- PCR(Polymerase Chain Reaction)
: 중합효소 연쇄반응(polymerase chain reaction, PCR)은 1983년 Kary Mullis에 의해 고안 되었는데 이는 80년대 제한효소의 발견에 의한 Gene Cloning법에 이어 90년대를 화려 하게 장식한 생명공학 연구의 혁명적인 사건이다. PCR은 특정 DNA 부위를 특이적으로 반복 합성하여 시험관내에서 원하는 DNA 분자를 증폭시키는 방법으로서, 아주 적은 양의 DNA를 이용하여 많은 양의 DNA 합성이 가능하므로 분자 생물학적으로 제한효소의 발견만큼 획기적인 것이라고 할 수 있다.

참고자료

· -http://blog.naver.com/kidarime?Redirect=Log&logNo=100021064539www.genehunters.co.kr
· - http://biochemistry.yonsei.ac.kr/biochem_molecular/gene_cloning_13.php
· -http://blog.naver.com/dextermh/10010236507