일반생물학실험1 2차 풀레 GFP 단백질과 단백질 정량(100점)

소개

"일반생물학실험1 2차 풀레 GFP 단백질과 단백질 정량(100점)"에 대한 내용입니다.

목차

1. Abstract

2. Introduction

3. Meterial & Method
1) Lowry assay
2) Extinction coefficient assay

4. Results
1) Lowry assay
2) Extinction Coefficient assay

5. Discussion

6. Reference

본문내용

1. Abstract
본 실험은 Lowry assay, Extinction coefficient assay의 두 단백질정량법과 분광광도계를 수행하여 EGFP(Enhanced Green Fluorescent Protein)의 흡광도와 질량농도를 측정하고 표준곡선을 이해하며, 두 결과를 비교하는 것에 그 목적이 있다. 본 실험에서 사용하는 EGFP는 GFP를 변형시킨 것으로 높은 몰흡광계수(〖61,000 cm〗^(-1) M^(-1))를 가진다. Lowry assay에서는 BSA(Bovine Serum Albumin)를 사용하여 750 nm에서의 흡광도 표준 곡선을 그린 후 이를 바탕으로 EGFP의 농도를 구한다. Extinction coefficient assay는 아미노산이나 단백질의 특이한 흡광도를 이용하는데 EGFP는 488 nm에서 높은 흡광도를 가지기 때문에 functional 한 EGFP의 농도를 알아낼 수 있다. 두 방법 모두 분광광도법을 통해 흡광도를 측정하는데 분광광도계의 신뢰구간은 A=0.01~0=1.0이므로 시료를 농축, 희석해 사용해야 한다. 본 실험에서는 시료를 희석하였기 때문에 질량농도를 계산할 때 희석 배수를 곱해주었다. 실험 결과, Lowry assay에서 EGFP의 질량농도는 0.45 mg/ml, Extinction coefficient assay에서는 0.551 mg/ml가 나와 오차가 발생하였다. 오차의 원인은 Tyr, Trp, Cys의 잔기 수에 따라 환원되는 Folin reagent의 수가 달라 같은 단백질 농도를 사용해도 흡광도가 다를 수 있기 때문이며, 시료 분주 시간의 차이, 빛의 노출, pipetting의 부정확성 등이 있다. 또한 cuvette에 묻은 이물질로 인한 흡광도의 변화가 있으며 오차를 줄이기 위해 암막에서 신속하게 Lowy assay를 진행하고, cuvette에 이물질이 묻지 않게 주의해야 한다.

참고자료

· David L. Nelson(2023), 레닌저 생화학, 월드사이언스, 80~89p
· Geoffrey M. Cooper(2019), The cell, 월드사이언스, 161p
· Winters Ana L, Minchin Frank R(2005), Modification of the Lowry assay to measure proteins and phenols in covalently bound complexes, Analytical Biochemistry, 43~48p