Cell harvest and protein assay 레포트

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- 🔬 분자생물학 실험의 기초 프로토콜 상세 설명
- 🧬 Western blot을 위한 Sample preparation 과정 상세 분석
- 📊 단백질 정량 및 추출 방법의 체계적인 가이드
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미리보기

소개

"Cell harvest and protein assay"에 대한 내용입니다.

목차

1. 서론

2. 재료 및 방법
1) Cell harvest
2) Protein extraction
3) Protein assay
4) Sample preparation

3. 결과

4. 논의

본문내용

Western blot은 여러 물질의 혼합물에서 단백질을 분리하고 어떤 단백질이 있는지 확인하는 데에 중요한 기술이다. 크게, 전기영동으로 단백질을 분리하고, 막으로 옮기고, 항체를 이용해 어떤 단백질이 있는지 확인하는 3단계로 구성된다.(Tahrin Mahmood and Ping-Chang Yang, 2012) 이번 실험에서는 전기영동으로 단백질을 분리하기 위한 Sample preparation을 진행하였다.
Sample preparation은 Cell harvest, protein extraction, protein assay, SDS-page(전처리)의 4가지 과정으로 나눌 수 있다. Cell harvest는 medium에 배양되고 있는 세포를 한곳에 모으는 것을 말한다. Cell은 배양되는 위치에 따라 adherent Cell과 suspension Cell로 나눌 수 있다. adherent cell은 어딘가에 붙어서 배양되는 cell이고 suspension cell은 액체에서 부유하며 배양되는 cell이다. (Vanessa Noel and Mark D Berry, 2022 and Modeline N Longjohn at al., 2022) 이번 실험에서 사용하는 cell은 배지에 붙어있는 adherent cell이다. adherent cell을 harvest하는 과정은 크게 화학적 방법과 물리적 방법으로 2가지가 존재한다. 화학적인 방법은 trysin을 이용하는 방법과 accutase를 이용하는 방법이 있다. trypsin은 대표적인 단백질분해효소인데, cell과 플라스크를 붙어있게 해주는 단백질을 분해하여 떨어뜨리게 만든다. accutase는 콜라겐을 분해하여 세포를 떼어내는데, trypsin보다 더 손상이 적은 장점이 존재한다. 물리적인 방법은 말그대로 scraper을 이용해서 플라스크를 긁어 세포를 떼어내는 방식이다.(A. Nowak-Terpiłowska at al., 2021)

참고자료

· Tahrin Mahmood and Ping-Chang Yang(2012), Western Blot: Technique, Theory, and Trouble Shooting
· Vanessa Noel, Mark D Berry(2022),
· Culture of Adherent Cancer Cell Lines
· Modeline N Longjohn, Hong-Dien Phan, Sherri L Christian(2022), Culturing Suspension Cancer Cell Lines
· A. Nowak-Terpiłowska, P. Śledziński, and J. Zeyland(2021), Impact of cell harvesting methods on detection of cell surface proteins and apoptotic markers
· Mohammed Shehadul Islam, Aditya Aryasomayajula, and Ponnambalam Ravi Selvaganapathy(2017), A Review on Macroscale and Microscale Cell Lysis Methods
· ThermoFisher Scientific Overview of Protease and Phosphatase Inhibition for Protein Preparation, https://www.thermofisher.com/kr/ko/home/life-science/protein-biology/protein-biology-learning-center/protein-biology-resource-library/pierce-protein-methods/protease-phosphatase-inhibitors.html(2024. 04. 02 인용)
· Noble, James E. (2009). [Methods in Enzymology] Chapter 8 Quantitation of Protein
· creative proteomics, Protocol for Bradford Protein Assay, https://www.creative-proteomics.com/resource/protocol-for-bradford-protein-assay.htm(2024. 04. 02 인용)
· Bio-chae(2020), Western blot buffer 역할/ western blotting buffer 역할/ 웨스턴블롯 buffer 역할 / 웨스턴블롯 버퍼 역할, https://bio-chae.com/western-blot-buffer/(2024. 04. 02 인용)
· A Alam(1992), A model for formulation of protein assay
· B.A. Otieno, C.E. Krause, J.F. Rusling(2015), [Methods in Enzymology] Chapter 7 Bioconjugation of Antibodies and Enzyme Labels onto Magnetic Beads
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AI와 토픽 톺아보기
- 1. Cell harvest
  
  Cell harvest is a critical step in many biotechnology and pharmaceutical processes, as it involves the separation and collection of cells from a culture or suspension. The choice of cell harvest method can significantly impact the yield, purity, and viability of the final product. Factors such as cell type, culture conditions, and downstream processing requirements must be carefully considered when selecting the appropriate cell harvest technique. Centrifugation, filtration, and affinity-based methods are commonly used, each with their own advantages and limitations. Optimizing the cell harvest process is essential to ensure the efficient and consistent production of high-quality biomolecules and therapeutics.
- 2. Protein extraction
  
  Protein extraction is a fundamental technique in biochemistry and molecular biology, as it involves the isolation and purification of proteins from complex biological samples. The choice of extraction method can greatly influence the yield, purity, and structural integrity of the target proteins. Factors such as the nature of the sample, the properties of the target protein, and the intended downstream applications must be considered. Common extraction methods include mechanical disruption, chemical lysis, and affinity-based techniques, each with their own strengths and limitations. Optimizing the protein extraction process is crucial to ensure the successful isolation of high-quality proteins for a wide range of research and industrial applications, including enzyme studies, structural analysis, and the development of therapeutic proteins.
- 3. Protein assay
  
  Protein assays are essential analytical tools used to quantify the concentration of proteins in a sample. Accurate protein quantification is crucial in various fields, such as biochemistry, cell biology, and biotechnology, where the precise measurement of protein levels is required for experimental design, process optimization, and quality control. A wide range of protein assay methods are available, each with their own advantages and limitations in terms of sensitivity, specificity, and compatibility with different sample types and interfering substances. The choice of protein assay depends on factors such as the available equipment, the nature of the sample, and the desired level of accuracy and precision. Careful optimization and validation of the protein assay protocol are necessary to ensure reliable and reproducible results, which are essential for making informed decisions in research, development, and production settings.
- 4. SDS-PAGE 전처리
  
  SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate-Polyacrylamide Gel Electrophoresis) is a widely used technique for the separation and analysis of proteins based on their molecular weight. The pre-treatment of samples is a critical step in the SDS-PAGE process, as it ensures the effective denaturation and solubilization of proteins, allowing for their efficient separation and visualization. Factors such as the choice of denaturing agent, the concentration of SDS, the presence of reducing agents, and the incubation time and temperature can all impact the quality and reproducibility of the SDS-PAGE results. Proper sample preparation, including the removal of interfering substances and the optimization of the pre-treatment conditions, is essential to obtain reliable and interpretable protein profiles. Careful attention to the SDS-PAGE pre-treatment steps can lead to improved resolution, better band separation, and more accurate molecular weight determination, which are crucial for various applications, such as protein characterization, identification, and quantification.
자료후기
Ai 리뷰

이 문서는 Western blot 실험을 위한 Sample preparation 과정을 상세히 설명하고 있으며, 각 단계별 원리와 방법론을 잘 정리하고 있다.

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