총 9개
-
His tagged eGFP 단백질의 발현 및 정제2025.12.171. eGFP 단백질 발현 및 정제 His tagged eGFP 단백질을 E.coli BL21(DE3) 시스템에서 과발현시키고 affinity chromatography를 통해 정제하는 과정. pET28a(+) vector에 eGFP 유전자를 클로닝하고 IPTG로 유도하여 6x His tagged eGFP를 과발현. Sonication으로 세포를 파괴하고 His tag와 니켈 이온의 친화성을 이용한 정제. Ultrafiltration으로 농축하여 최종 정제 단백질 획득. 2. 단백질 정량 방법 비교 Extinction coeffic...2025.12.17
-
항체 생산 및 Immunoblotting을 이용한 eGFP 검출2025.12.171. 항체 생산 (Antibody Production) 항체는 B림프구에서 생성되는 항원 특이적 수용체로, 정제된 eGFP를 쥐의 복강에 Freund's adjuvant와 함께 주사하여 1차 항체를 생산한다. 3주에 걸쳐 3회 접종 후 심장 채혈을 통해 혈청을 수집하고, 10% glycerol을 첨가하여 -70℃에 보관한다. Polyclonal antibody는 다양한 항원 결정기를 인식하는 여러 B림프구에서 생성되며, monoclonal antibody는 단일 항원 결정기만 인식하여 더 높은 특이성을 가진다. 2. SDS-PAGE...2025.12.17
-
6x His tagged eGFP의 과발현, 정제 및 정량 분석2025.12.191. 단백질 발현 및 정제 기술 6x-His tagged eGFP를 pET28a(+) 플라스미드 벡터를 이용하여 BL21(DE3) 숙주 세포에서 과발현시켰다. IPTG 유도제를 사용하여 Lac operon을 활성화하고 T7 RNA polymerase를 통해 고효율 전사를 달성했다. Sonication으로 세포를 파괴하여 단백질 혼합물을 얻었고, IMAC(Immobilized Metal Ion Affinity Chromatography)를 통해 니켈 이온과 히스티딘의 결합을 이용하여 목표 단백질을 정제했다. Ultrafiltratio...2025.12.19
-
GFP 단백질 정량 실험: Lowry assay와 Extinction coefficient assay 비교2025.12.131. Lowry Assay Lowry assay는 Biuret reaction과 Folin reaction이 합쳐진 단백질 정량 방법이다. Cu2+와 folin reagent의 산화환원반응을 바탕으로 하며, Tyr, Trp, Cys가 산화되면서 750nm 파장에서 파란색을 띠는 heteropolymolybdenum blue가 형성된다. 표준곡선을 이용하여 미지의 단백질 농도를 계산하는 방식으로, 아미노산 조성에 따라 측정값이 영향을 받을 수 있다는 한계가 있다. 2. Extinction Coefficient Assay Extinct...2025.12.13
-
6XHis-tagged eGFP 발현, 정제 및 특성 분석2025.12.141. Green Fluorescent Protein (GFP) 및 enhanced GFP (eGFP) GFP는 해파리 Aequorea Victoria에서 발견된 단백질로 238개의 아미노산으로 이루어져 있으며 27kDa의 크기를 가진다. eGFP는 GFP의 64번 아미노산인 Phenylalanine을 Leucine으로, 65번 아미노산인 Serine을 Threonine으로 변형한 형태로, 더욱 강한 형광을 나타낸다. eGFP는 488nm에서 excitation하고 509nm에서 emission하며, 26.9kDa의 monomer 크...2025.12.14
-
[생물공정실험] 1주차 Mammalian suspension cell culture 결과보고서2025.04.261. EGFP 유전자 발현 조절 이번 실험에서는 CRISPR-CAS9을 이용해 EGFP 유전자 발현을 조절하는 방법을 사용했다. EGFP 유전자를 발현시키려면 promoter 유전자가 존재해야 하고, 발현시키지 않으려면 promoter 유전자를 제거해야 한다. 2. CHO-S 세포 배양 이번 실험에서는 CHO-S 세포를 사용했다. CHO-S 세포는 부유하면서 자랄 수 있어 배양 속도와 공간 활용도가 adherent 세포에 비해 좋아 생산성이 높으므로 산업적으로 잘 쓰인다. 또한 인간과 진화적으로 가까워 human-like PTM, ...2025.04.26
-
eGFP 항체 생산 및 Western blotting 분석2025.12.191. 면역반응과 항체 생산 면역반응은 외부 물질에 대한 세포의 방어 반응으로 비특이적 방어와 특이적 방어가 있다. 특이적 방어는 항원을 인식하여 일어나는 후천적 반응으로 세포성 면역과 체액성 면역으로 구분된다. 항체는 B림프구에서 생성되는 면역글로불린으로 항원과 특이적으로 결합하는 Y형 구조를 가진다. 1차 면역반응에서 항체가 생성되고, 같은 항원이 재침입할 때 2차 면역반응이 일어나 더 빠르고 다량의 항체가 생산된다. 2. Western blotting 기술 Western blotting은 SDS-PAGE로 분리한 단백질을 mem...2025.12.19
-
GFP 단백질 정량 실험: Lowry assay와 Extinction coefficient assay 비교2025.12.191. Lowry Assay Lowry assay는 Biuret reaction과 Folin reaction을 결합한 단백질 정량법으로, 높은 검출 감도(1 μg)를 가진다. 알칼리성 환경에서 펩타이드 결합과 Cu2+가 복합체를 형성하고, Folin reagent를 환원시켜 750 nm에서 파란색을 띤다. 본 실험에서 BSA를 표준 단백질로 사용하여 표준곡선을 작성했으며, EGFP의 질량농도는 0.45 mg/ml로 측정되었다. 그러나 Tyr, Trp, Cys 잔기 수에 따라 흡광도가 달라지고, 시약 분주 시간 차이, 빛 노출, pip...2025.12.19
-
서강대학교 일반생물학실험1 실험 6. GFP 단백질과 단백질 정량 (Protein Measurements)2025.01.021. 단백질 정량 방법 실험에서는 Lowry assay와 Extinction coefficient assay 두 가지 단백질 정량 방법을 사용하여 EGFP의 질량농도를 측정하였다. Lowry assay는 Biuret reaction과 Folin reaction을 거쳐 750nm에서 흡광도를 측정하고 BSA 표준곡선을 이용하여 EGFP 농도를 계산하였다. Extinction coefficient assay는 EGFP의 몰흡광계수와 Lambert-Beer's Law를 이용하여 488nm에서 EGFP 농도를 직접 계산하였다. 두 방법의 ...2025.01.02