[생물공정실험] 3주차 Gene expression analysis by RT-PCR 예비보고서

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문서 내 토픽

• 1. cDNA 정의 및 합성 방법

  cDNA(complementary DNA)는 RNA를 주형으로 역전사효소와 DNA 중합효소에 의해 합성된 DNA입니다. 역전사효소를 이용한 cDNA 합성에서는 RNA와 annealing 위치에 따라 3종류의 primer를 사용할 수 있습니다. (1) 역전사 효소 (reverse transcriptase; RTase), (2) RT반응에 사용하는 primer (oligo dT primer, random primer, gene-specific primer).

• 2. Downstream application of cDNA

  cDNA는 qPCR, RNA-seq, microarray 등의 다양한 분석에 활용될 수 있습니다. qPCR은 PCR 증폭산물의 증가를 실시간으로 모니터링하여 정량할 수 있고, RNA-seq은 transcriptome 분석을 통해 발현 transcript 정보를 얻을 수 있습니다. Microarray는 이미 알려진 유전자의 발현량을 측정할 수 있습니다.

• 3. cDNA 합성 시 control의 종류와 그 이유

  cDNA 합성 결과를 검증하기 위해 다음과 같은 음성 대조군 반응이 필요합니다. (1) Reverse transcriptase negative control: 역전사 효소를 넣지 않아 DNA 오염을 평가할 수 있습니다. (2) No template control(NTC): 시약 오염을 평가할 수 있습니다. (3) No primer control: RNA 샘플에 오염된 DNA 조각이 primer로 작용할 수 있어 DNase 전처리가 필요합니다.

• 4. cDNA 합성 실험 방법

  cDNA 합성 실험 방법은 다음과 같습니다. A. cDNA synthesis: (1) 시약 혼합 및 반응, (2) 37°C 2분 반응, (3) 25°C 10분, 50°C 15분 incubation, (4) 85°C 5분 가열로 반응 종료. B. RT-PCR: PCR mix 준비 및 98°C 30초, 58°C 30초, 72°C 15초의 20 cycles 수행. C. Agarose gel electrophoresis: 증폭된 cDNA 확인.

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• 1. cDNA 정의 및 합성 방법

  cDNA(complementary DNA)는 RNA 분자를 주형으로 하여 역전사 효소를 이용해 합성된 DNA 분자입니다. cDNA 합성은 다음과 같은 과정으로 이루어집니다. 먼저 RNA 분자를 추출하고 정제합니다. 그 다음 역전사 효소와 프라이머를 이용해 RNA 분자를 상보적인 DNA 분자로 전사합니다. 이때 프라이머로는 oligo(dT) 프라이머나 랜덤 프라이머를 사용할 수 있습니다. 마지막으로 RNase 처리를 통해 RNA 분자를 제거하고 정제 과정을 거쳐 최종적인 cDNA를 얻게 됩니다. cDNA 합성은 유전자 발현 분석, 유전자 클로닝, 유전체 연구 등 다양한 분야에서 활용됩니다.

• 2. Downstream application of cDNA

  cDNA는 다양한 분야에서 활용될 수 있는 중요한 분자생물학적 도구입니다. 첫째, 유전자 발현 분석에 활용될 수 있습니다. cDNA를 이용한 RT-PCR, Northern blotting, RNA-seq 등의 기법을 통해 특정 유전자의 발현 수준을 정량적으로 분석할 수 있습니다. 둘째, 유전자 클로닝에 활용될 수 있습니다. cDNA 라이브러리를 구축하고 원하는 유전자를 선별하여 클로닝할 수 있습니다. 셋째, 유전체 연구에 활용될 수 있습니다. cDNA를 이용한 유전자 발현 프로파일링, 유전자 기능 연구 등이 가능합니다. 넷째, 단백질 발현 및 정제에 활용될 수 있습니다. cDNA를 발현 벡터에 클로닝하여 재조합 단백질을 생산할 수 있습니다. 이처럼 cDNA는 유전자 및 단백질 연구에 다양하게 활용될 수 있는 중요한 분자생물학적 도구입니다.

• 3. cDNA 합성 시 control의 종류와 그 이유

  cDNA 합성 실험에서는 다음과 같은 종류의 대조군(control)이 사용됩니다. 첫째, 음성 대조군(negative control)은 RNA 대신 물을 사용하여 역전사 반응을 수행합니다. 이를 통해 실험에 사용된 시약이나 기구에 오염된 DNA가 없음을 확인할 수 있습니다. 둘째, 양성 대조군(positive control)은 이미 알려진 유전자의 cDNA를 합성하여 실험의 성공 여부를 확인합니다. 셋째, 내부 대조군(internal control)은 실험 과정 중 발생할 수 있는 오차를 보정하기 위해 사용됩니다. 예를 들어 housekeeping 유전자의 cDNA를 동시에 합성하여 이를 기준으로 다른 유전자의 발현 수준을 정량화할 수 있습니다. 이와 같은 다양한 대조군을 사용하면 cDNA 합성 실험의 신뢰성과 재현성을 높일 수 있습니다.

• 4. cDNA 합성 실험 방법

  cDNA 합성 실험은 다음과 같은 단계로 진행됩니다. 첫째, RNA 추출 및 정제 단계입니다. 세포나 조직에서 RNA를 추출하고 정제하는 과정이 필요합니다. 둘째, 역전사 단계입니다. 추출한 RNA를 주형으로 하여 역전사 효소와 프라이머를 이용해 상보적인 cDNA를 합성합니다. 이때 oligo(dT) 프라이머나 랜덤 프라이머를 사용할 수 있습니다. 셋째, RNase 처리 및 정제 단계입니다. 합성된 cDNA에서 RNA 분자를 제거하고 정제 과정을 거쳐 최종적인 cDNA를 얻습니다. 넷째, 품질 확인 단계입니다. 합성된 cDNA의 농도와 순도를 측정하고 PCR 등의 방법으로 목표 유전자의 증폭 여부를 확인합니다. 이와 같은 실험 과정을 통해 고품질의 cDNA를 얻을 수 있습니다.