1. Introduction술은 구강 및 혀에서 극미량이 없어지고 위에서 20%, 나머지는 소장내에서 흡수된다.체내에서 흡수된 알코올은 혈관을 통해 간으로 이동되어 간에서 분비되는 알콜분해요소인 ADH와 ALDH에 의해 식초산으로 분해되면서 혈액을 통해 2-3분내에 온몸에 퍼진다. 술에 의해 생성된 에너지는 체내에서 지방으로 저장되지 않는다.적으로 많이 가지고 있는 사람은 술에 강하고 적게 갖고 있는 사람은 술에 약하다.술을 마시면 술에 포함된 알코올(ethanol, C2H5OH)이 위장에서 흡수돼 혈액 속으로 들어간다. 이 알코올은 간으로 운반된 후 알코올탈수효소(alcohol dehydrogenase, ADH)에 의해 분해돼 아세트알데히드(acetaldehyde,CH3CHO)란 물질로 바뀐다.아세트알데히드는 다시 아세트알데히드 분해효소(ALDH)에 의해 아세트산과 물로 분해돼 소변으로 배설된다. 그런데 아세트알데히드는 상당한 독성을 지닌 물질로 몸안에 쌓이면 정신이 몽롱해지거나 어지럼증이 생기고 속이 울렁거려 구토를 일으킨다. 알코올은 간에서 또한 효소 cytochrome P450IIE1 (CYP2E1)에 의해서도 분해되며, 이 효소 또한 장기적인 음주로 증가될 수 있다.어떤 사람이 술에 강하다는 것은 바로 아세트알데히드 분해효소가 남들보다 많거나, 그 작용이 활발하기 때문이다. 반대로 술에 약한 사람은 이 효소가 매우 적거나 그 작용이 약한 경우인데, 자주 술을 접하게 되면 적응력이 높아지기도 한다.하지만 일부 사람들에게는 선천적으로 아세트알데히드 분해효소가 전혀 없어 소량의 술에도 민감한 반응이 일어나 술을 전혀 마시지 못하는 경우도 있다.ADH란 무엇인가?...(alcohol dehydrogenase )----알코올에서 수소를 이탈시켜 알데히드를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소.모든 화학반응은 반응물질 외에 미량의 촉매가 존재함으로써 반응 속도가 현저히 커지는데, 생물체 내에서도 모든 화학반응이 이 촉매에 의해 속도가 빨라진다. 다만 무기 반도나 pH(수소이온농도) 등 환경 요인에 의하여 기능이 크게 영향을 받는다. 즉, 모든 효소는 특정한 온도 범위 내에서 활성(活性)이 가장 크게 나타난다. 대개의 효소는 온도가 35∼45 에서 활성이 가장 크다. 이것은 온도가 올라가면 화학반응 속도가 일반적으로 커짐에 따라 효소의 촉매작용도 커지지만, 온도가 일정 범위를 넘으면 화학반응 속도는 커져도 단백질의 분자 구조가 변형을 일으켜 촉매 기능이 떨어지기 때문이다. 또 효소는 pH가 일정 범위를 넘으면 기능이 급격히 떨어진다. 이것은 단백질의 구조가 그 주변 용액의 pH의 변화에 따라 달라지고, 효소 작용은 특정 구조를 유지하고 있을 때에만 나타나기 때문이다.효소는 아무 반응이나 비선택적으로 촉매하는 것이 아니고, 한 가지 효소는 한 가지 반응만을, 또는 극히 유사한 몇 가지 반응만을 선택적으로 촉매하는 기질특이성(基質特異性)을 가지고 있다. 기질이란 효소에 의하여 반응 속도가 커지게 되는 물질, 즉 효소에 의하여 촉매작용을 받는 물질을 말한다. 효소에 이와 같이 기질특이성이 있는 것은 효소와 기질이 마치 자물쇠와 열쇠의 관계처럼 공간적 입체구조가 꼭 들어맞는 것끼리 결합하여, 그 결과 기질이 화학반응을 일으키기 때문이라고 해석하는 이론도 있다. 효소 가운데 비교적 잘 알려져 있는 것이 소화효소(消化酵素)인데, 가령 침 속에 있는 프티알린(ptyalin)은 녹말만을 말토오스(일명 맥아당)로 분해하는 촉매작용을 가지고 있고, 또 위 속의 펩신(pepsin)은 단백질만을 부분 가수분해하는 기능을 가지고 있다. 여기서 프티알린은 분자의 입체구조가 녹말 분자와 꼭 들어맞는 구조를 하고 있어서 녹말만을 분해하는 것이며, 펩신은 단백질 분자와 꼭 들어맞는 구조를 하고 있어서 위와 같은 기질특이성이 생기는 것이라고 해석된다반응식은 다음과 같다.CH3CH2OH＋NAD+ CH3CHO＋NADH＋H+alcohol dehydrogenase는 알코올발효의 최후의 단계에 관여하며, 조효소로서 NAD(조효소 I)를 필요로 한다. 효모특이성은 낮으며, 여러 가지 제1알코올 제2알코올을 산화하여 알데히드 또는 케톤을 생성한다.NAD란 무엇인가?.... [ nicotinamide adenine dinucleotide ]많은 기질과 탈수소효소로부터 수소를 받아 NADH2를 형성하는 수소수용체로서 분자식은 C21H28N7O14P2이다. 디포스포피리딘뉴클레오티드(DPN), 코드히드로게나아제 I 또는 조효소 I이라고 부르기도 한다. 자외선 흡수스펙트럼은 260nm에서 극대(極大)를 나타낸다. 각종 탈수소효소에 의하여 기질로부터 수소원자 1개와 전자 l개를 받아들여 환원형이 된다. E'0=－0.32V. 이 때, 피리딘 고리가 환원되어 340nm에서 극대를 가지는 흡수대(吸收帶)를 나타내므로 반응 진행을 측정할 수 있다. 이 반응은 가역적으로도 진행된다. 따라서, NAD+은 각종 탈수소효소에 공통되는 일종의 기질인데, 2종의 탈수소효소 사이에 작용하여 미량의 존재로 2종의 기질 사이의 산화환원을 촉매하게 된다. 그 예로 발효(發酵)가 있다.AH2(글리세르알데히드-3-인산)＋H2PO4 ＋NAD+A(글리세르산-1, 3-이인산)＋NADH＋H+ B(아세트알데히드)＋NADH＋H+BH2(에탄올)＋NAD+또, NADH는 직접 분자상 산소에 의하여 산화되지 않지만, NADH 탈수소효소에 의해 수소이탈이 되어 NAD+이 된다. 호흡사슬에서는 이것에 의하여 플라빈 퀴논 시토크롬이 차례로 환원되어, 결국 산소가물로 환원된다. 이와 같이, NAD의 중개로 기질이 산소에 의하여 산화되는 경로는 호산소성생물(好酸素性生物)에서 볼 수 있는 주요한 유기물 산화과정(酸化過程)이다.2. 실험 재료 및 과정.①.......실험 재료.............Na-Pyrophosphate buffer 900 l , NAD+ 10 l , Sodium-phosphate buffer 10 l,D.W 70 l , EtOH 10 l , ADH 10 l....②......실험 과정............. 먼저 대조군을 만들기 위해서 cubet에 Na-P l ,의 각 Volume를 넣어준다.(spectrophotometer에서 "0"을 맞추어 준다.). 또 다른 cubet에 Na-Pyrophosphate buffer 900 l, NAD+ 10 , D.W 70 l ,EtOH 10 l 에 ADH를 더 첨가하여 넣어준다.. spectrophotometer를 이용하여 흡광도를 측정한다.. 이러한 과정을 3번 반복한다.ReferenceVoumeControlVolumeNa-Pyrophosphate buffer900 lNa-Pyrophosphate buffer900 lNAD+10 lNAD+10 lSodium-phosphate buffer10 lADH10 lD.W70 lD.W70 lEtOH10 lEtOH10 lTatal1mLTatal1mL3. 실험 결과.SD 평균 * 100% = 10% 이하일 경우 정상① Standard Deviation (SD ; 표준 편차) -0.00618② control을 3번 제작하여 activity 측정 결과+--activity 0.0777+--activity 0.0684+--activity 0.0801평균 : 0.07540.0068 0.0754 * 100% = 8.196%약 8%로 10%이하이기 때문에 정상이다.③사용한 ADH stocksodium - phosphate buffer 에 ADH 가루를 0.004g/ml 녹임.|| 1/100 dilution3 l/300 l(1,2조는 3 l/300 l를 쓰고, 3,4조는 1/2를 더 dilution한 ADH를 쓴다)data의 1,2조와 3,4조의 결과가 비슷하게 나왔다.activity +- 1조 ; 0.0722+- 2조 ; 0.0752+- 3조 ; 0.0419+- 4조 ; 0.04044. Discussion술은 구강 및 혀에서 극미량이 없어지고 위에서 20%, 나머지는 소장내에서 흡수된다.체내에서 흡수된 알코올은 혈관을 통해 간으로 이동되어 간에서 분비되는 알콜분해요소인 ADH와 ALDH에 의해 식초산으로 분해되면서 혈액을 통해 2-3분내에 온몸에 하다.술을 마시면 술에 포함된 알코올(ethanol, C2H5OH)이 위장에서 흡수되어 혈액 속으로 들어간다. 이 알코올은 간으로 운반된 후 알코올탈수효소(alcohol dehydrogenase, ADH)에 의해 분해되어 아세트알데히드(acetaldehyde,CH3CHO)란 물질로 바뀐다.아세트알데히드는 다시 아세트알데히드 분해효소(ALDH)에 의해 아세트산과 물로 분해되어 소변으로 배설된다. 그런데 아세트알데히드는 상당한 독성을 지닌 물질로 몸 안에 쌓이면 정신이 몽롱해지거나 어지럼증이 생기고 속이 울렁거려 구토를 일으킨다. 알코올은 간에서 또한 효소 cytochrome P450IIE1 (CYP2E1)에 의해서도 분해되며, 이 효소 또한 장기적인 음주로 증가될 수 있다.우리가 이번 실험을 통해서 알고자 하는 것은 바로 알콜을 acetaldehyde로 분해시키는 효소인 ADH의 양이 얼마나 들어있는지 정량하는 것이다ADH (alcohol dehydrogenase)라고 하는 효소는 알코올에서 수소를 이탈시켜 알데히드를 생성하는 반응을 가역적으로 촉매하는 효소이다.CH3CH2OH＋NAD+ CH3CHO＋NADH＋H+alcohol dehydrogenase는 알코올발효의 최후의 단계에 관여하며, 조효소로서 NAD(조효소 I)를 필요로 한다. 또한 효모 고등식물 동물의 간 세균 등에 존재하며 효모로부터 결정으로 분리한 효소의 분자량은 15만이며, 모노요오드아세트산에 의해 작용이 저해된다. 이 효소의 기질특이성은 낮으며, 여러 가지 제1알코올 제2알코올을 산화하여 알데히드 또는 케톤을 생성하게 된다.NAD +는 많은 기질과 탈수소효소로부터 수소를 받아 NADH2를 형성하는 수소수용체로서 분자식은 C21H28N7O14P2이다. 디포스포피리딘뉴클레오티드(DPN), 코드히드로게나아제 I 또는 조효소 I이라고 부르기도 한다. 자외선 흡수스펙트럼은 260nm에서 극대(極大)를 나타낸다. 각종 탈수소효소에 의하여 기질로부터 수소원자 1개와 전자 l개를 받아들여 환원형이 된다. E'0다.
1. Introduction분자 생물학 실험의 기본 재료인 DNA는 많은 양을 확보함으로써 제한효소처리, sequencing 반응 등 다양한 실험을 수행 할 수 있다. DNA를 확보할 수 있는 방법으로는 E. coli에 plasmid DNA 또는 M13 phage DNA 등을 transformation 또는 transfection시켜서 transformant(혹은 transfected cell)를 증식시킴으로써 동시에 그 내부의 DNA 또는 phage를 증폭하여 분리하거나, 최근의 PCR 기술을 이용하여 in vitro 상에서 효소와 primer등을 첨가함으로써 증폭하는 방법이 있다.이 실험에서는 plasmid DNA를 E. coli host에 transformation시키는 방법에 대해서 실험하였다.♠ alpha-complementation ♠pUC나 M13mp 계열같이 β-galactosidase 효소의 일부분에 해당하는 α-fragment의 유전자를 지니고 있는 벡터들은 α-complementation 현상을 이용하여 벡터 DNA 와 insert DNA 간의 재조합 여부를 확인할 수 있다. lacZ (β-galactosidase 를 암호화)유전자의 5' 부분이 deletion되어 있는 대장균은 β-galactosidase의 C-terminal 부분에 해당하는 단백질인 ω-fragment만을 발현하는데, 이것은 효소 활성이 없다. 마찬가지로 lacZ 유전자의 3' deletion이 있는 대장균은 N-terminal 부분의 α-fragment 만을 만들게 된다. 그런데 두 가지의 deletion 유전자가 한 세포 내에 존재하면 각각 개별적으로 발현된 α- 및 ω-fragment가 결합하여 정상적인 효소 활성을 나타낸다. 많은 종류의 벡터는 lac α-fragment를 갖고 있는데, 이 부분에 외부 DNA를 연결할 수 있는 multicolning site가 들어 있어서 ligation 결과 성공적으로 insert DNA가 연결되면 벡터에서 정상적인 α-frag떤 일부는 세균사이에서 이동한다. 세균이 용해될 때 그들은 주위환경으로 DNA을 방출한다. 이 단편들은 상대적으로 크고 여러 개의 유전자들을 포함한다. 만약 단편이 competent 세포와 접촉하면 DNA를 추출할 수 있고 형질전환이 되며 그것은 세포에 결합되고 안으로 들어갈 수 있다. competent세포의 형질전환 빈도는 DNA의 초과 양이 사용될 때 대부분의 속에서 10-3근처이다.♣ 형질전환의 메커니즘 ♣competent 세포는 만약 그 단편이 적당하게 크다면 이중 가닥으로된 DNA단편과 결합한다.이 과정은 임의적이며 그리고 공여 단편은 다른 것과 경쟁한다. DNA흡수는 에너지 소모를 필요로 한다. 하나의 가닥은 외피와 연결된 exonuclease에 의해 수소결합으로 되어 있다. 다른 가닥은 작은 단백질로 연결되고 원형질막을 통해 이동한다. 단일가닥으로 된 단편은 게놈의 상응하는 지역으로 정렬되고 평균적으로 되어있다.그람 음성세균인 Haemophilus influenzae에서의 형질전환은 여러 면에서 S.pneumoaiae에서와 다르다. aemophilus는 competence 의 발달을 자극하는 competence인자를 생성하지 못한다. 그리고 그것은 오로지 상대적인 종으로부터 DNA를 추출할 수 있다. 단백질로 복잡화된 이중가닥의 DNA 는 막소낭에서 추출된다. Haemophilus의 형질전환의 특별성은 특별한 11개 염기쌍 서열(5'AAGTGCGGTCA3')에 기인하고 Haemophilus influenzae DNA에서 600번 재현된다.♣ Competent cell 이란? ♣DNA를 받아들일 수 있는 능력을 가진 cell을 말하며, E.coli strain을 0.1M CaCl2 처리를통하여 얻을 수 있다. 보통 사용하는 E.coli 균주는 M13 phage DNA 경우 XLI-Blue가사용되며 plasmid transformation을 위한 균주는 DH5α 또는 XLA-Blue 등이 사용된다.♣ 형질전환시 E.coli의 특성 ♣Plasmid의 흡이라는 말은 DNA분자의 흡수를 세포에서 감지할 수 있고,또 그 변화를 알 수 있거나 또는 DNA를 흡수하는 세포는 세균, 진균, 동물, 식물에상관없이 확대되었다.♣ 저항성이 나타나는 원리는? ♣저항성은 plasmid에 의해 암호되고 항생물질의 독성을 제거하는 효소가 형질 전환된 세포에서 만들어짐으로써 나타난다. 접종하기 전에 세포들은 항생물질이 없는 소량의 액체배지에서 잠시동안 배양한다. 이러한 처리는 plasmid의 복제와 발현을 시작하도록 하며, 이 세포들이 접종되고 항생물질에 접했을 때는 이미 생존하기에 충분히 필요한 저항성 효소가 합성되어 있다.2. 실험재료 및 과정.bacto-trypton 1.0gbacto-yeast extract 0.5gNaCl 1.0g→NaOH로 pH 7.0으로 적정.★LB medium (Luria- Bertani medium) - 100ml 제조 ★→ 위에서 제조한 LB medium을 각각 50ml 과 40ml로 나누어 삼각 플라스크에 분주한다.→50ml 삼각 플라스크는 competent cell 제조용으로 autoclave 한다.→40ml 삼각 플라스크는 plate 제조용 (LB plate 20ml / ALB plate 20ml)을 0.6g agar를 넣 어주고 autoclave 한다.→autoclave 후 LB plate를 먼저 제조 후 바로 ALB plate를 제조 하는데 여기서 70μg/ml ampicillin을 넣고 흔들어 준 후 제조.bacto-trypton 2gbacto-yeast extract 0.5gNaCl 0.05g★ SOC medium 100ml 제조 ★→ 위 조성에 250mM KCl 1ml 첨가 후 NaOH로 pH7.0으로 적정 후 100ml volume up→autoclave를 시킨 후 1M glucose 2ml과 2M MgCl 2 0.5ml 첨가하여 SOC medium 제 조.★competent cell 만들기 과정★1.멸균된 LB 배지 3ml에 cell ( E.coli )을 접종하여 250rpm, 3e DW 15ml 다시 넣고 잘 섞는다.9. 3500rpm, 0℃에서 15분 동안 원심분리 한다 (원심분리기는 미리 켜 놓는다.)10. 원심분리 후에 centrifuge tube를 조심스럽게 꺼내서 상층액을 버리고 얼음에 보관.11. autoclaved DDW 15ml을 위 centrifuge tube에 넣고 잘 섞어 준다.12. 다시 autoclaved DDW 15ml을 위 centrifuge tube에 넣고 잘 섞어 준다.13. 3500rpm, 0℃에서 15분 동안 원심분리 한다.(원심분리기는 미리 켜 놓는다.)14. 조심스럽게 tube를 꺼내서 상층액을 버리고 잠시 얼음에 보관한 뒤15. 냉장 보간해 둔 10% glycerol 멸균액을 15ml로 세포를 현탁시키고 얼음에 5분간 보관.16. 다시 15ml 10% lycerol을 넣고 잘 흔들어 준 후 얼음에 5분간 보관.17. 5800rpm(대략 4000*g), 0℃에서 15분 동안 원심분리 한다.18. 대부분 glycerol을 버린다.19. 1ml에 10% glycerol을 tube에 넣고 vortexing 하여 세포를 현탁시키고 얼음에 보관20. 냉장 보관해 둔 microtube에 위 세포 현탁액을 옮겨 담고 -70℃ 냉장고에 보관한다.★ Transformation ★1.준비된 vector 1μl 와 제조한 competent cell 80μl을 섞은 후 30분간 incubation 한다.2. 위 mixture를 cuvette 에 넣고 electro-transformation을 한다.3. transformation 후 mixture를 SOC medium 에 넣고 1hr 37℃ 250rpm 으로 incubation한 다.4. ampicillin이 든 LB plate에 40μl X-gal (20mg/ml), 4μl IPTG (200mg/ml)을 spreading 후 위 3번 배양액을 이 plate에 spreading 한다.5. 위 plate를 37℃에서 12 ~ 16hr incubation.6. 4℃ 에 1tation 먼저 transformation(형질전환) 시키기 위해서 기본적으로 필요한 competent cell을 제작하였다compent cell이란 DNA를 받아들일 수 있는 능력을 가진 cell을 말하며, E.coli stain을 0.1M CaCl 2 처리를 통하여 얻을 수 있다. 보통 사용하는 E.coli 균주는 MB phage DNA 경우 XL1- Blue가 사용되며 plasmid transformation을 위한 균주는 DH5 α 또는 XL1-Blue 등이 사용된다.처음 단계인 멸균된 LB 배지 3ml에 E.coli cell을 접종하여 overnight 시키는데. overnight으로 preculture 한 것을 1/100 부피로 배양하는데 보통 2시간 정도 키우면 OD 값이 0.5 ~ 0.6을 나타내는 cell density가 되지만 너무 오래 키울 경우 건강하지 않은 E.coli가 많아지게 되기 때문에 주의하면서 실험하였다.원심 분리한 후에 상층액을 버리고 얼음에 약간 보관한 뒤 CaCl 2를 넣을 수도 있는데. Calcium은 cell membrane에 영향을 주어서 외부의 DNA가 cell 속으로 잘 들어가도록 만들어 주는 기능을 한다. 이것은 membrane이 뻣뻣해져서 틈이 생겼을 때 그 사이로 DNA가 통과 할 것으로 생각된다 이렇게 만들어진 competent cell에 원하는 vector를 transformation시키기 위해 이 실험을 하였다. 먼저 LB plate 와 ampicillin이 들어 있는 ALB plate를 각각 제조한다. 그리고 준비된 vector DNA와 competent cell을 혼합하여 incubation 해야 하는데. 이 실험에 쓰인 vector에는 ampicillin gene과 lac Z gene과 SOD gene , MCS gene이 들어 있다. 우리는 이 실험에서 lac Z gene이 발현하여 나온 enzyme인 β-glactosidase가 첨가해 준 인공색소 기질인 X-gal을 분해하여 blue colo다.
![[효소 ] ADH assy](https://image4.happycampus.com/Production/thumbnail/2001/11/08/data1050309-0001.jpg)
[효소 ] ADH assy
평가A+최고예요
![[유전공학] transformation](https://image4.happycampus.com/Production/thumbnail/2001/11/08/data1050310-0001.jpg)
