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[면역학]면역학 토끼 항원투여

* What happen in FCA injection siteAt the site of injection FCA causes a chronic inflammatory response that may be severe and painful for the animal depending on the site as well as quantity and quality of adjuvant injected. The inflammatory response may result in formation of chronic granulomas, sterile abscesses and/or ulcerating tissue necrosis.Adjuvant-induced lesions may appear to be metastatic when excessive amount of the emulsion are injected in a single site.

자연과학| 2006.04.09| 4페이지| 1,500원| 조회(252)

면역학, FCA, immune, Antigen, adjuvant

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[생화학] 단백질정량

1제목:Protein Concentration Determination(단백질 농도 결정)2목적: 생화학 실습의 기본인 단백질 농도 결정의 방법을 이해한다.3재료 및 방법:-재료: 분광 광도계항온기셀피펫테스트 튜브-방법:1. standard 용액을 만든다. BSA 10mg에 100ml 의 증류수를 혼합한다. (1㎎/㎖).2. BSA 0, 10, 20, 30, 40(μg)을 50μl 씩 만든다.3. Reagent A와 Reagent B을 혼합한 Standard Working Reagent (SWR) 900μl를 각 시험관에 넣은 후 37℃에서 30분동안 incubation 한다.4. 색 변화를 관찰한다.5. 농도가 작은것부터 차례로 562nm에서 흡광도를 잰다.6. Unknown sample의 흡광도를 잰다.7. 위 실험결과를 토대로 Linear regression을 재고 R2값을 구한다.8. 방정식을 이용하여 Unknown sample의 농도를 계산한다4.결과?반응 후 용액을 색농도05102030Unknown1Unknown2흡광도00.0970.1580.3730.5080.1390.266Unknown1 : 0.139 = 0.0172X + 0.0031∴X = 7.90Unknown2 : 0.266 = 0.0172X + 0.0031∴X = 15.285결과 토의? 단백질 정량분석단백질 검출을 통한 단백질의 정량 분석하는 방법에는 대표적으로 뷰렛반응(칼슘이온이 펩타 이드와 결합하여 색이 변하는 원리를 이용, 감도 1-10mg), 로우리법(Lowry: 금속성 이온이 고리형구조의 잔기를 가진 아미노산과 결합하는 원리, 감도 20-300 μg), BCA 법(Lowry법을 응용, BCA reagent 사용), 브래드포드법(쿠마시블루라는 염색약과 염기성 아미노산(라이신) 의 결합으로 색이 변함, 감도 1-100μg), 그리고 자외선법(고리형 구조의 아미노산이 280nm 의 파장을 가지는 빛을 흡수하는 원리를 이용)이 있다. 단백질을 정량분석하기 위해서는 우선 가수분해시켜야 한다. 단백질을 가수분해하면 Peptide Bond가 끊어져 Amino Acid로 나뉘는 데, 단백질은 보통 6N HCl용액에 단백질을 넣고 공기를 제거하고 밀봉하여 100C에서 8시 간~24시간 동안 가열하여 가수분해 시킨다. 이런 가열조건에서는 모든 Peptide Bond가 파 괴되며 Amino Acid 중 Glutamine과 Asparagine은 Side Chain의 Amino Bond까지 파괴된 다.Tryptophan, Serine, 그리고 Threonine 등의 Amino Acid는 쉽게 파괴될 수 있으므로, 이 러한 아미노산을 포함한 단백질의 경우 특별한 주의를 필요로 한다. Acid Solution에서 파괴 된 Amino Acid를 분석하기 위해서는 단백질을Alkaline Hydrolysis 시켜 분석한 후 보정한다. 즉 ,단백질의 양을 정량하기 위해서는 단백질의 본질, 단백질 시료에 포함된 여러 기타 성분, 정량분석의 신속도 및 정밀도 등에 따라 알맞은 Method를 선택해야 한다.?단백질 농도 결정 방법- Ninhydrin 반응아미노산과 ninhydrin을 가열 반응시키면 그림 3.21에 나타낸 것처럼 아미노산의 산화분 해가 일어나 환원된 ninhydrin과 암모니아, 이산화탄소, aldehyde가 생성되며 다음에 환 원된 ninhydrin과 암모니아, ninhydrin이 반응하여 Ruhemann's purple이라는 청자색의 색 소가 생성한다.그 외에도 여러 가지 색소가 생성하나 이것이 주된 생성물이다. 아미노산 에서의 발색은 보통 자색이지만 histidine, glycine에서는 적회색, phenylalanine,tyrosine, aspartate는 청색, proline은 황색으로 발색된다. 2㎍∼0.2㎍의 아미노산을 검출 할 수 있다. 이 반응은 peptide와 단백질에서도 일어난다.-Bradford AssayBradford assay는 dye인 Coomassie blue G250이 protein에 binding한다는 사실에 기 초한다. Coomassie blue G250은 네 가지 ionic form으로 존재하며 각각의 pKa는 1.15, 1.82, 12.4 이다. Acidic assay reagent solution에서는 more cationic red and green form이 predominate하고, 각각 470nm와 650nm에서 maxima absorbance를 보 인다. 이때 more anionic blue form은 protein에 binding하며 590nm에서 maximum absorbance를 보인다. 따라서 protein의 quantity는 blue ionic form으로 존재하는 dye 의 양을 결정함으로써 추정될 수 있는데, 이것은 보통 595nm에서 solution의 absorbance를 측정하여 구한다.이 dye는 protein의 arginyl and lysyl residues에 가장 쉽게 결합하는 것으로 보인다. (Free amino acids에는 결합하지 않는다) 이러한 specificity 때문에 assay시 protein마다 response에 있어서 variation이 나타나며, 이 것은 이 method의 main drawback이다. Original Bradford assay는 protein마다 큰 편 차를 보였다. 그래서 이 문제를 극복하기 위해 몇 가지 modifications가 개발되었으나, modification을 하면 일반적으로 다른 chemicals에 의한 interference에 더 취약해지기 때문에, original method가 가장 편리하고 널리 사용되는 formulation으로 남게 되었다.Bradford method는 Lowry method보다 더 간단하고, 시간이 더 적게 걸리고 sensitivity도 더 높으며, 다른 chemical에 의한 interference도 더 적다는 장점이 있다.- Kjeldahl법보통 단백질의 질소함량은 약 16%(12∼19%)이므로 질소함량을 정량하여 단백질량을 구 하는 방법이 고안되어 있다. 단백질 함유시료를 진한황산 중에서 가열분해하면 유기화합 물 중의 질소는 암모니아로 되고 황산암모늄으로 반응액 중에 남는다. 분해반응 후 용액 을 알칼리성으로 하여 유리하는 암모니아를 수증기와 함께 증류하고 산성용액에 다시 흡 수시켜 적정, 비색 등의 방법으로 정량한다. 이렇게 하여 얻어진 암모니아량으로부터 시 료 중의 단백질량을 계산하는 방법이 Kjeldahl법이다. 시료 중에 단백질 이외의 함질소화 합물이 있는 경우나 질소함량이 매우 많거나 적은 단백질의 경우는 오차가 크게 된다. 이 방법은 감도가 좋고 식품과 같은 단백질 혼합물의 단백질함량을 분석하는데 적당하 다.-Phenol 시약법Phenol류와 반응하여 발색하는 시약을 phenol 시약이라 하며 특히 Folin의 시약이 단백 질 정량에 자주 이용된다. Folin 시약은 주로 몰리브덴산나트륨, 텅스텐산나트륨과 인산 으로 만들며 환원제와 반응하여 복잡한 착체인 인몰리브덴산 블루를 형성하여 청색을 나 타낸다. 단백질 분자 중의 tyrosine(phenol의 일종), tryptophan은 산화되기 쉬워서 환원 제로 작용하며 이들 아미노산을 함유하는 단백질은 Folin 시약으로 발색, 정량할 수 있 다. Folin의 방법을 biuret법과 조합시켜 감도를 향상시킨 Lowry법도 단백질의 정량에 많 이 이용된다.-Lowry AssayLowry법은 Biuret법과 함께 단백질 정량의 표준으로 사용되는 method이다. Lowry법은Biuret법 보다 감도가 좋지만, 몇 가지 이유로 제한적으로 사용된다. 우선 결합된 시약의불안정성하며, 색의 재현성이 떨어지고(특히낮은농도에서) 마지막으로 단백질 농도에 따른흡광도의 비선형성이 그 이유이다. Onishi 와Barr1는Lowry 과정에서 biuret 시약을변형시킴으로써 결합된 시약의 안정성을 개선하였다.Lowry법에서 생기는 청색은(1)Biuret반 응에서와 같이Cu2+이 펩티드 결합과 반응하는데 기인되며, (2)포스포몰리브덴산을함유하는 착화합물시약(페놀시약, Folin 시약, Lowry 시약,Folin-Ciocalteau 시약)을 단백질에 있는 티 로신과 트립토판잔기들이 환원하는데도 기인된다.-Principle산성용액에서 coomassiebrilliant blue 염료는 단백질과 결합하게 되고, 이로인해 염료의 최대흡광도(λmax)는 465nm에서 595nm로 이동하게 된다. 595nm에서의 흡광도는 단백 질의 농도와 비례하므로 정량이 가능하게 된다. 이 방법은 발색 반응이 2분 이내에 완결 되며, 1시간까지 안정성이 유지된다. Bradford 방법의 감도는 Lowry 방법보다 좋으며, 미량 정량법(microassay)을 사용하면1~20mg의 단백질량을 측정할 수 있다. Bradford 방법은 빠를 뿐만 아니라 비단백질 성분들에 의한 방해도 거의 없다. 정에 방해성분으로 알려진 것으로는Triton X -100과 황산도데실나트륨(SDS)이 있다.-Biuret 방법뷰렛(NH2-CO-NH-CO-NH2)은 알칼리성 CuSO4와 반응하여 보라색의 착 화합물을 형성 한다. 두 개 이상의 펩티드 결합을 가진 화합물도 마찬가지로 유사한 착 화합물을 만들며 단 백질의 경우에는 청자색 또는 적자색을 나타낸다. 이 원리를 이용하여 단백질을 정량 한다. 보통이 방법으로는 약1~10mg의 단백질을 정량 할 수 있지만, 미량 뷰렛법은 약 0.25~2.0mg 까지 정량 할 수 있는 감도를 가진다. 착 화합물의 색은1~2시간 동안은 안정 하지만, 그 이상의 시간에서는 점점 색도가 증가한다.

자연과학| 2005.09.14| 5페이지| 1,000원| 조회(2,341)

단백질, 화학, 단백질정량, 정량, 정량법

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[생화학실험] SDS-PAGE

1. SubjectSDS-PAGE (sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)2. Introduction◆SDS-PAGE◆-Sodium dodecyl sulfate-polyacryamide gel electrophoresis (SDS-PAGE)는 단백질을 정제하는 동안 이를 monitor하고, 정제된 단백질의 동질성(homogeneity)을 알기 위한 가장 좋은 방법이다. SDS-PAGE는 일반적으로 단위체의 분자량을 결정하고, 정제된 단백질의 단위체 구성을 알기 위해 사용된다. SDS-PAGE는 더 깊은 연구를 위한 충분한 단백질을 얻기 위해 scale up될 수 있다. 또한, SDS-PAGE와 Isoelectric focusing을 결합시킨 2차원 분석법은 해상도(resolution)가 아주 좋은 방법으로서 하나의 gel에서 수천 개의 polypeptide를 분리할 수 있다.그리고 Blotting method와 결합해서 사용하면 단백질들의 homology를 분석할 수 있다. 이처럼 SDS-PAGE는 단백질 분석에 이용할 수 있는 강력한 수단을 제공한다.Gel electrophoresis에 대한 세부적인 이론이 복잡하고 현재로서는 불완전할지라도, 그 기본적인 개념은 쉽게 이해될 수 있다. 간단히 말해서 전기영동 분석은 전하를 띤 입자들이 외부에서 공급된 전기장의 영향을 받아서 반대 부호를 가진 전극 쪽으로 이동하는 데서 기인한다. 입자들의 움직임은 주위의 molecular sieve로서 역할을 하는 gel matrix와의 상호작용에 의해 지연된다. 전기장의 세기와 gel matrix의 pore size에 따라서 sample 안에 있는 단백질의 이동 속도가 달라진다.일반적으로, 전기영동에 의한 분리는 분자의 크기, 모양, 전체 전하의 상대적인 양(net charges)에 기초한다.System은 전기영동 이동도(electrophoretic mobility)에 대한 크기, 모양, 전하의 효과를 구별할 sacrylamide: cross-linking agent)Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N,N'-methylene bisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer이다가교제로는 N,N'-methylene bisacrylamide이 (일반적으로 bisacrylamide라 한다) 많이 사용되고 있으며, 또는 N,N'-bisacrylylcystamine (BAC), N,N'- diallyltartardiamine (DATD), Ethylene diacrylate (EDIA) 등도 특수한 목적으로 사용되기도 한다.샘플을 로딩하고 전기를 걸어주면 이온들은 (+)쪽으로 진행하게 된다.이 때 이동되는 것이 단백질, Cl 이온, Glycine 이온등이 있다.이 경우 단백질은 SDS에 둘러싸여 있어서 모드 음전하를 띠고 있고 Cl- 역시 음전하를 띤다. 문제는 글리신인데 이것의 pI (Net Charge 가 0이 되는 pH)가 대략 6.2 정도이다. 따라서 글리신은 pH6.8의 Stacking gel에서 일부만 음전하를 띠게 되는 것이며 결국 Stacking gel에서의 이온들의 이동속도는 Cl- > 단백질 > Glycine 이온의 순서가 된다.전기장을 걸어주었을 때 염소이온은 가장 작기 때문에 가장 먼저 이동하고 글리신은 늦게 이동하게 된다. 이렇게 이온들간의 이동의 차이가 생기면 그 사이에는 국부적으로 High Voltage gradient가 만들어지게 되며 결국 그 안의 단백질의 움직임은 매우 빠르게 움직이게 되는 것을 의미한다.이렇게 단백질의 이동속도가 두 이온(염소이온,글리신잉온)사이에서 빨라진다는 것은 단백질 크기가 크거나 작은 것의 차이로 인한 이동속도 차이를 거의 없게 만드는 의미가 있다. 물론 여기서 폴리아크릴아마이드의 조성도 상대적으로 작아 큰 단백질도 쉽게 내려갈 수 있는 이유도 있겠지만 보다 본질적으로 큰 단백질의 이동속도가 염소/글리신이온으로 형성되는에서는 염소/글리신 이온간의 gap에 크기에 관계없이 단백질들이 모여서 이동하게되고 (Stacking이라 불리는 이유) 이것은 이후 Running gel에서 Starting line을 동일하게 만들어 줌으로 분자크기간의 비교를 좀 더 정확하게 볼 수 있게 되는 것이다.◆SAMPLE BUFFER 의 조성 및 역할◆STOCK SOLUTIONS FOR SDS-PAGE (Laemmli Nature 227:680, 1970)30% Acrylamide + 0.8% Methylene Bisacrylamide (BIS)30 g acrylamide + 0.8 g methylene bisacrylamidemake up to 100 ml with ddH2Ostore in brown bottle at 4CLower Tris Buffer (4X) (1.5 M Tris-HCl pH 8.8 + 0.4% SDS)181.5 g Tris base (Trizma) + HCl ---> pH 8.8make up to 1 l. with ddH2Ostore at room temperatureUpper Tris Buffer (4X) (0.5 M Tris-HCl pH 6.8 + 0.4% SDS)6.06 g Tris base + HCl ---> pH 6.8make up to 100 ml with ddH2OTris-glycine Buffer (4X) pH 8.312.1 g Tris base + 57.68 g glycine (Sigma ammonia-free)make up to 1 l with ddH2OSample Buffer (10X)12.5 ml Upper Tris Buffer (4X) + 10 ml glycerol + 30 ml 10% SDSmake up to 100 ml with ddH2OSample Buffer (4X)5.0 ml Upper Tris Buffer (4X) + 10 ml glycerol + 30 ml 10% SDS100% (w/v) Trichloro Acetic AcidAdd 227 mnium sulfate136 ml 85% phosphoric acidmake up to 4 l with ddH2O? Tris : 전류가 흐를 수 있도록 전도체 역할을 해준다? Glycerol : 단백질이 가라앉도록 한다.? SDS(Sodium dodecyl sulfate, NaSO₃) : 음전하의 계면활성제로 3차구조를 1차구조로 변경하여 아미노산 두분자당 한분자의 SDS가 결합하게 된다. SDS는 SO₃-때문에 -전하를 띤다.? 2-Mecaptoethanol : 환원제로 아미노산의 S-S bond를 끊는다.? Bromophenol blue : protein을 염색시키는 역할을 한다.? DDW◆running gel과 stacking gel의 조성 및 차이점◆① running gel mix의 조성(pH 8.8)10%SDS 0.2㎖ + 1.5M Tris-HCL(pH8.8) 5㎖ + TEMED 10㎕ + DDW 8.7㎖ + 40% Acrylamide mix 5㎖ + 10%APS 100㎕② stacking gel mix의 조성(pH 6.8)10%SDS 40㎕ + 1.5M Tris-Hcl(pH 6.8) 1.008㎖ + TEMED 4㎕ + DDW 2.236㎖ + 40% Acrylamide mix 0.5㎖ + 10% APS 40㎕③ 차이점stacking gel에서는 염소/글리신 이온간의 gap에 크기에 관계없이 단백질들이 모여서 이동하게되고 (Stacking이라 불리는 이유) 이것은 이후 Running gel에서 Starting line을 동일하게 만들어 줌으로 분자크기간의 비교를 좀 더 정확하게 볼 수 있게 된다.Running gel의 경우 pH는 8.8 정도로 이제 Glycine은 완전히 이온화가 되어 모든 단백질보다 빠르게 움직일 수 있게 된다. 즉 Running gel에서의 이온들의 이동속도는 Cl- > Glycine > 단백질 이온의 순서가 됩니다. 이렇게 되면 염소/ 글리신이온사이의 영역도 거의 없을 뿐 아니라 있다 하더라도 단백질은 이에 무 관하게 움직인다. % APS, 4X sample buffer (Tris + Glycerol +SDS + 2-Mecaptoethanol + Bromophenol blue + DDW), 1X sample buffer (Tris + Glycerol +SDS + 2-Mecaptoethanol + Bromophenol blue + DDW),Electrophoresis buffer(Tris + Glycine + SDS + DDW), coomassie Blue stain solution, De-staining solution(Methanol + Acetic acid + DDW)◎ 장비Micro-tube, Power supply, Mini gel kit(Hofer), Heater, Centrifuge, Micro-piprtte, Timer, StirTANK Buffer-boat, 5분 동안 뜨거운 물에 띄움, Dry bath에 넣어 5분 동안 끓이기도 한다.standard size maker - protein-120,86,47,34,26,204.procedure【SDS-PAGE】① sample과 4X sample buffer를 mix 했다.② 100℃에서 5분간 끓여줬다.③ 12000rpm으로 10초동안 원심분리 했다.④ minigel에 loading 시켰다.⑤ 180V로 1시간동안 전압을 걸어줬다.⑥ gel을 뜯어낸 후, 15분간 coomassie blue stain solution으로 염색 시켰다⑦ destain solution으로 destaining하였다.⑧ iluminator로 확인했다.【 Running gel 만들기】① 70% 에탄올로 이물질이 묻지 않게 mini gel판을 한쪽방향으로 닦아 주었다.② 새지 않도록 잘 맞추어서 고정틀에 넣었다.③ 밑부분이 거칠은 것은 잘 맞지 않았다는 것이므로 재시도 하였다.④ 10%SDS 0.2㎖ + 1.5M Tris-HCL(pH8.8) 5㎖ + TEMED 10㎕ + DDW 8.7㎖ + 40% Acrylamide mix 5㎖ + 10%APS 100

자연과학| 2005.06.06| 8페이지| 1,000원| 조회(1,865)

전기영동, SDS, isoelectric

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[화학] 단백질 농도 결정 평가D별로예요

2005년 3월 29일 Protein Concentration Determination1. 제목 : Protein Concentration Determination- using Bicinchoninic acid(BCA) assay2목적: 생화학 실습의 기본인 단백질 농도 결정의 방법을 이해한다.3재료 및 방법:-재료: 분광 광도계항온기셀피펫테스트 튜브-방법:1. standard 용액을 만든다. BSA 10mg에 100ml 의 증류수를 혼합한다. (1㎎/㎖).2. BSA 0, 10, 20, 30, 40( g)을 50 l 씩 만든다.3. Reagent A와 Reagent B을 혼합한 Standard Working Reagent (SWR) 900 l를 각 시험관에 넣은 후 37 에서 30분동안 incubation 한다.4. 색 변화를 관찰한다.5. 농도가 작은것부터 차례로 562nm에서 흡광도를 잰다.6. Unknown sample의 흡광도를 잰다.7. 위 실험결과를 토대로 Linear regression을 재고 R2값을 구한다.8. 방정식을 이용하여 Unknown sample의 농도를 계산한다4.결과반응 후 용액의 색{{{농도05102030Unknown1Unknown2흡광도00.0970.1580.3730.5080.1390.266Unknown1 : 0.139 = 0.0172X + 0.0031X = 7.90Unknown2 : 0.266 = 0.0172X + 0.0031X = 15.285.discussion* 단백질의 정량법1) Kjeldahl법Kjeldahl법은 단백질(또는 식품, 질소를 포함하는 다른 유기물)의 총 질소량을 정량하는 데 널리 이용되는 방법이다.단백질을 촉매(예: CuSo₄,SeO₂,HgO)의 존재 하에서 진한 황산과 함께 오래 끓이면 그 질소는 모두 (NH4)2SO₄로 된다. 이 혼합물의 일정량에 과량의 NaOH를 넣고 증류하여 이 때 발생되는 암모니아를 H3BO₃용액에 흡수시킨 후 표준 산 용액으로 적정하여 암모 니아의 양, 나아가서는 질소의 양을유사한 착화합물을 만들며 단백질의 경우에는 청자색 또는 적자색을 나타낸다. 이 원리를 이용하여 단백질을 정량한다. 578nm에서 특이적으로 빛을 흡수하며, 단백질의 농도가 짙을수록 더 진한 violet색을 띤다. 보통 이 방법으로는 약 1 ~ 10mg의 단백질을 정량할 수 있지만, 미량 비우렛법은 약 0.25~2.0mg까지 정량할 수 있는 감도를 가진다. 착화합물의 색은 1~2시간동안은 안정하지만, 그 이상의 시간에서는 점점 색도가 증가한다. 시료에 CuSO₄또는 rochelle염과 CuSO₄를 가하여 540~560nm으로 흡광 도를 측정하거나 CuSO₄와 NaOH혼액을 시료에 혼합하여 263nm,310nm의 흡광도를 측정하는 방법이다. 이 방법은 단백질의 종류에 따라 발색율의 변동이 적고 시약의 조제, 조작이 간단하나 감도가 나쁘고 다량의 당류가 공존되거나 proline을 함유한 peptide에서는 점색 이 나빠 낮은 값을 나타낸다. 또 유사파장의 공존물질에도 방해된다.3) Lowry법Lowry등이 고안한 이 방법은 용액에 있는 단백질뿐만 아니라 건조된 시료에서도 이용될 수 있다. Biuret반응과 phenol시약의 환원 정색반응을 병용한 방법이다. 이 방법은 감도가 높으나 조작이 약간 복잡하다. 발색은 단백질의 종류에 따라 변동되나 미지의 시료의 경우는 주의를 하여야 한다. 특히 이 정량법은 5㎍/ml 정도의 단백질의 양을 정량할 수 있는 대단히 민감한 방법이어서 널리 쓰이고 있다. 이 Lowry법에서는 사용하는 Folin-Ciocalteau시약에 의한 발색의 비우렛 실험에서와 마찬가지로 단백질과 알카리성 구리와의 반응에 포스포몰리브데산-포스포팅스텐산 염들이 단백질에 있는 티로신과 트립토판들에 의한 환원반응으로 생긴다. 이 두 아미노산의 함량은 단백질의 종류에 따라서 상당히 다르므로 1mg의 단백질에 대한 색의 세기가 일정하지가 않다. 표준곡선을 결정하는데 사용한 단백질이 나타나는 색의 세기와 다를 수 있다. 그럼에도 불구하고 이 방법은 단백질을 정제하는 많이 사용되는 결점이 있다. 그러나 여지전기 이동법은 장치가 간단하고 시료가 미량이라도 충분하다.5) 방사선 동위원소법Radioisotape으로 표식화한 단백질의 방사능을 이용한 동위체 희석법이다. 이 방법은 일반화 되지 않고 있으나 14C,{`_{ }^{35 } { }S,{`_{ }^{ 3} { }H 등의 방사선 동위원소가 사용된다. 이외에도 색소법, 비탁법 등이 간혹 이용된다.6) 자외선 분광광도법에 의한 단백질의 정량비우렛 반응 및 Lowry법에 의한 단백질 정량은 발색제를 가하여 발색시켜 가시광선 영역에서 측정하는 방법이지만, 발색시키지 않고 시료용액 중의 단백질을 직접 측정하는 방법이 있다. 단백질에 있는 티로신, 페닐알라닌 및 트립토판 잔기들은 각각 275nm와 280nm의 자외선을 흡수한다. 많은 단백질들에 있어서의 이 아미노산들의 합친 수준은 거의 일정하므로 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도와 비례하게 된다. 물론 예외가 있기는 하지만 순수한 단백질의 경우 단백질의 농도가 1mg/ml이고 자외선이 통과하는 경로가 1cm일 때 280nm에서의 흡광도는 1.0이다. 따라서 대부분의 순수한 단백질의 농도는 280nm에서의 흡광도를 측정함으로써 신속히 결정할 수 있다. 이 방법은 정량하는 데 시간이 적게 들 뿐만 아니라 정량하고 난 후의 단백질을 완전히 회수하여 재이용할 수 있는 이점이 있다.유감스럽게도 자연물들에는 280nm에서 흡광을 나타내는 그 밖의 화합물들이 많이 있다.특히 핵산은 260nm에서 최대 흡수를 가지고 있지만 280nm에서도 흡광도가 상당히 크다. 그러므로 A280/A260을 알면 280nm에서의 핵산의 흡광에 대한 보정을 할 수 있다. Warburg-Christian법({{A }`_{280 } ^{ }/{{A}`_{260} ^{ }법)과 Waddell법({{A}`_{215} ^{ }-{{A}`_{225} ^{ }법)이 있다.(1) Warburg-Christian법({{A }`_{280 } ^{ }/{{A}`_{260} ^{ }하게 흡광한다는 사실을 이용함으로써 이 문제를 극복할 수 있다. 이 방법의 감도는 0.05~2.0mg단백질/ml이다.Warburg-Christian은 효모에서 얻은 결정상태의 엔놀라아제와 순수한 핵산을 사용하여 이 두 성분을 여러 비율로 섞은 혼합물들에 대하여 280nm와 260nm에서의 흡광도를 측정하였다.방 법증류수를 바탕값으로 하여 280nm와 26nm의 두 파장에서 각각 미지시료의 흡광도를 측정한다.{{A }`_{280 } ^{ }/{{A}`_{260} ^{ }비를 계산하고 표 21-3에서 적절한 보정계수를 찾아서 다음 식에 따라 미지시료 중의 단백질 농도를 계산한다.{{A }`_{280 } ^{ }X 보정계수 = 시료용액 1ml당 단백질의 mg 수경험적으로, 단백질의 경우에는 시료용액 1ml의 단백질의 농도가 1.0mg일 때 {{A }`_{280 } ^{ }=1.0 이고, 핵산(RNA,DNA)의 경우에는 시료용액 1ml핵산의 농도가 40㎍일 때 {{A}`_{260} ^{ }=1.0라는 것을 알아두면 편하다.(2) Waddell법({{A}`_{215} ^{ }-{{A}`_{225} ^{ }법)이 방법은 230nm이하에서 단백질 용액의 흡광도가 급격히 증가하는 사실에 근거를 두고 있다. 이러한 흡수를 말단흡수(end absorption)이라고 하며, 주로 펩티드 결합에 기인한 다. 이 방법의 감도는 10~100㎍단백질/ml이다.방 법증류수를 바탕값으로 하여 215nm와 225nm의 두 파장에서 각각 미지 시료용액의 흡광도를 측정한다. 전자의 흡광도로부터 후자의 흡광도를 빼어, 식에 따라 농도를 계산한다.7) Ninhydrin Reaction시약이 단백질의 아민기에 Ninhydrin 결합을 하여 복합체가 빛을 흡수하여 Ruhemann's Purple색을 띤다. 단백질에는 아민기가 한정되어 있으므로 시약과 결합하는 단백질의 수에 제약이 있기 때문에 민감도가 약하다.8) BCA(Bicinchoninic acid)정량법step 1. Protein + Cu2+ C정하여 목적성분의 농도를 정량하는 방법이다. 강도 IO 되는 단색광속이 [그림]과 같이 농도 C, 길이 I되는 용액층을 통과하면 이 용액에 빛이 흡수되어 입사광의 강도가 감소한다. 통과한 직후의 빛의 강도 It와 Io사이에는 Lambert-Beer 법칙에 의하여 다음의 관계가 성립한다.{It : 투시광의 농도Io : 입사광의 농도C : 시료의 농도: 빛의 투과거리: 흡광계수( C=1 mol, =10 mm일 때 Ｅ의 값을 몰흡광계수라 하며 K로 표시한다.)It/Io = t 를 투과도, 이투과도를 백분율로 표시한 것 즉, t x 100 = T를 투과퍼센트라 하고 투과도의 역수의 상용대수 즉, log(l/t) 를 흡광도라 한다.흡광도를 이용한 Lambert-Beer 법칙을 식으로 표시하면 A = C 이 되므로 농도를 알고 있는 표준액에 대하여 흡광도를 측정하고 흡광계수를 구해 놓으면 시료액에 대해서도 같은 방법으로 흡광도를 측정함으로써 정량을 할 수 있다. 모든 종류의 단백질의 농도를 결정할 수 있는 완벽한 방법은 지금까지 알려져 있지 않다. 따라서 단백질의 양을 정량을 하기 위해서는 단백질의 본질, 단백질 시료에 있는 다른 성분들의 본질, 정량분석의 신속도 및 정밀도 등에 따라서 적당한 방법을 선택하여야 한다. Bradford protein assay는 단백질을 정량하는데 자주 사용되는 방법들을 중의 하나이다.1 Quantitative Analysis of Protein에서 고려할 사항1 the amount of protein available to assay.2 the concentration of the protein.3 the specificity of the assay.4 the presence of chemicals of performing the assay.5 the ease and reliability of performing the assay.UV absorption method1 원리단백질의 aromatic residue는 280㎚에서, 펩티드 결바꾼다.

자연과학| 2005.05.23| 6페이지| 1,000원| 조회(855)

단백질, Protein, 농도, 단백질농도, 단백질 농도 결정

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[화학] 화합물의 물리적 성질과 그 확인

3조 화합물의 물리적 성질과 그 확인1. 실험 제목: 화합물의 물리적 성질과 그의 확인2. 실험 목적: 화합물의 용해도, 밀도, 녹는점, 끓는점 등의 물리적 성질은 물질의 고유한 성질로서 물질의 순도를 결정하거나 화합물의 종류를 확인하는 데 매우 유용하다. 본 실험에서는 화합물의 용해도, 녹는점, 끓는점의 측정을 통해서 미지의 시료를 알아 맞춘다.3. 실험 이론: 화합물의 냄새, 끓는점, 녹는점, 비열, 그리고 상온에서의 상태등의 물리적 성질들은 화합물의 고유한 성질로서 물질의 순도를 결정하거나 화합물의 종류를 확인하는 데 매우 유용하다.화합물이 용매에 녹는 정도를 용해도라고 하며, 화합물은 용매의 종류에 따라 독특한 용해도를 나타낸다.화합물은 고유한 녹는점과 끓는점을 가지고 있다. 끓는점에서는 액체와 기체가 평형 상태에 있게 되고, 액체의 내부에서 기포가 발생하여 끓는 현상을 관찰할 수 있다. 끓는점은 압력에 대단히 민감하고, 1기압에서의 끓는점을 정상끓는점이라고 한다. 녹는점은 고체와 액체가 평형을 이루게 되는 온도이다. 녹는점과 끓는점은 분자들 사이의 인력이 클수록 녹는점과 끓는점이 높다.4. -실험 기구: 녹는점 측정용 모세관과 고무줄, 온도계, 비커, 가열기구, 시험관, 스탠드, 링, 클램프-실험 시약: 증류수, 에탄올, 벤젠, 기름 중탕용 파라핀 기름5. 시약 설명에탄올화학식 CH3CH2OH.특유한 냄새와 맛이 나는 무색 액체로, 분자량 46.07, 녹는점 －114.5 ℃,끓는점 78.3 ℃, 비중 0.7893이다. 다른 알코올 ·에테르 ·클로로포름 등 유기용매나 물과 임 의의비율로 섞인다제법: 예로부터 효모(酵母)에 의해서 당분(糖分)을 발효시키는 방법으로 제조되 었으며, 현재도 이 발효법은 대규모로 행해진다. 그러나 원료가 되는 당밀(糖蜜) 등의 가격이 비싸진 데다가 원료의 절반이 이산화탄소로 되어 낭비되는 결점이 있기 때문 에 점차 합성법으로 대체되어 가고 있다. 다만, 알코올 음료는 현재도 거의 발효법에 의해서 제조된다. 합성법으로서는 에틸렌을 황산에 흡수시켜 얻은 황산에스테르를 가 수분해하여 에테르와 함께 얻는 황산가수법(黃酸加水法)이 행하여지고 있는데, 이 공 정에서는 원료인 에틸렌의 90 %를 에테르와 함께 얻을 수 있어 수득률이 좋다. 그러 나 대량의 황산을 농축하여 순환시키므로 대규모의 설비를 필요로 한다. 이 밖에 요 오드합성법에 의한 합성도 가능하다.벤젠벤졸(benzole)이라고도 한다. 분자식 C6H6특유한 냄새가 나는 무색 액체로 분자량 78, 녹는점5.5℃, 끓는점 80.1 ℃이다. 휘 발성이 있다. 알코올 ·클로로포름 ·에테르 ·이황화탄소 ·사염화탄소 ·아세톤 등의 유 기용매에 녹지만, 물에는 잘 녹지 않는다.제법: 타르를 분별증류하면 얻을 수 있으나, 석유공업에서는 접촉분해나 접촉재질에 의하여 벤젠을 함유하는 탄화수소유를 얻고, 이것에서 추출 및 분류에 의하여 톨루 엔 ·크실렌을 함께 제조한다. 정제법으로 종래는 황산세정(洗淨)이 행하여졌으나, 최 근에는 몰리브덴산코발트 등을 촉매로 써서 350 ℃에서 가압수소정제법이 행해지게 되어, 높은 순도의 벤젠을 얻을 수 있게 되었다.6. 실험방법용해도: 미지의 액체 시료 또는 고체 시료 서너 알을 넣고, 약 2mL의 물을 가하고 잘 흔들어 준후의 상태를 관찰한다. 실험 결과를 S(잘녹음) sls(약간 녹음) I(녹지 않음) 로 구별 하여 기록한다. 같은 실험을 에탄올과 벤젠을 사용하여 반복한다.끓는점: 끓는점을 측정하기 위한 실험장치를 준비한다. 시험관에 약 5mL의 시료를 넣고, 온도 계의 수은구가 액체의 표면에서 2~5mL 정도 떨어지도록 고정시킨다. 끓임쪽을 넣고 가열하면서, 온도가 일정하게 유지되는 구간의 온도를 측정한다. 시료를 식힌 후에 다 시 한번 반복한다.

자연과학| 2004.05.27| 3페이지| 1,000원| 조회(2,458)

화학, 화합물, 물리적성질, 물리적성질확인, 성질확인

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