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Protein purification

Protein purification● 실험원리 (22. April. 2010)단백질의 정제는 유전자 재조합 기술을 이용하여 원하는 유전자 sequence 앞 또는 뒤에 특정 ligand에 affinity를 갖는 carrier를 보유한 Tag (fusion partner) 삽입, 발현하여 고순도로 정제를 하는 방법이다.※ 단백질을 purification하는 방법 3가지① Genetic recombinant technology : 가장 많이 쓰이는 방법. 세포배양을 통한 것으로, 유전자 재조합 기술에 의해 원하는 유전자를 박테리아에 삽입시켜 transformation을 시키고 이것을 배양하여 원하는 단백질만을 분리 정제하여 얻는 방법이다.② amino acid polymer : 화학합성에 의한 방법. 인위적으로 solid peptide 합성 기술을 이용하여 아미노산 중합체(amino acid polymer)을 만드는 것이다. 이 방법은 유기용매등 유해한 물질을 사용한다는 단점이 있다.③ 무세포 단백질 합성 시스템(or In vitro Transcription/Translation Proteins) : 장점은 단시간에 효율적으로 합성할 수 있으며, 분리, 정제 과정도 최소화 할 수 있는 것이 있으나, 가격이 매우 비싸고, 민감한 실험조건을 조절해 주어야 하는 문제점.1. Tag의 종류① 효소 tags : β-galactosidase, glutathione-S-transferase(GST)② 단백질 tags : protein A③ 금속친화성 : polyhistidine tag, Histidine tag④ 소수성 결합 : polyphenylalanine tag⑤ 이온교환수지 : polyalanine tag2. GST 의 expression(1) Vector1) pGEX vector- GST를 coding하는 sequence- tau promoter: IPTG에 의해 발현 유도2) pGEX vector 의 종류- pGEX-P, pGEX-T, pGEX-X, pGEX-2T은 E. coli가 lactose를 galactose와 glucose로 분해하는데 필요한 효소인 beta-galactosidase를 만드는 유전자이다.Lactose가 없을 때에는 불필요한 유전자인 beta-galactosidase는 생성되지 않는다. 그 이유는 유전자의 앞쪽에 있는 inhibitor region에서 생성된 inhibitor가 promotor 영역의 operator 부분에 결합하여 RNA polymerase 가 활동하는 것을 방해하여 beta-galactosidase가 생성되지 않도록 하기 때문이다.그러나 lactose가 배지에 있으면 IPTG 물질이 inhibitor와 결합하여 operator에서 떼어낸다. 따라서 RNA polymerase가 잘 작용하여 mRNA를 만들고, beta-galatosidase를 만들면서 lactose를 분해한다. 그 후 lactose가 다 분해되면 inhibitor가 다시 붙어 유전자는 turn off 될 것이다.이런 유전자 조절 기구를 실험에 이용하고자 하는 것이 바로 LacZ이다. 이 부분을 plasmid에 삽입해 놓게 되는데, 이때 LacZ operon이 동작하고 있는가 확인하기 위해서는 IPTG와 X-Gal이라는 두 가지 물질을 사용한다..※ 정리② The Host- full-length fusion proteins의 발현 최대화- cytoplasmic protease gene products (Lon, OmpT, DegP or HtpR들) 가 없음→ proteolytic degradation 최소화- BL21(DE3)pGEX vector을 가지고 cloning과 expression에 사용할 수 있는 E.coli host strains을 다양하지만, full-length fusion proteins의 발현을 최대화 할 수 있고 더 안정된 특별히 제작된 stains이 있다. 특히 cytoplasmic protease gene products로 알려진 Lon, OmpT, DegP or HtpR들이 없는 균주들은되기 때문에 다른 균주(cloning and maintenance of vector에 많이 쓰이는 균주 e.g. JM105)을 사용할 수 도 있다. 하지만, gene의 발현에 있어서의 연구는 BL21 균주가 선택적으로 쓰이고 있다. 그리고, pGEX plasmid의 증폭에 있어서 recA1 allele을 가지고 있는 E.coli strain은 사용하지 말아야 한다. 그들은 plasmid DNA안에 rearrangements or deletions을 야기 할 수 있다고 보고되고 있기 때문이다.3. GST-Recombinant Protein Purification전체적으로 간략하게 보면, 일단 insert DNA가 들어가있는 pGEX vector을 먼저 sequencing analysis을 거쳐 정확하게 sequence flame이 맞는지 확인 한다. 확인된 그 plasmid를 BL21에 transformation한다. 그 transformed BL21을 적당히 키운 상태에서 IPTG을 넣어서 GST-fusion (GST-recombinant) proteins을 발현 시켜준다. 발현 후에 그 cell을 sonication시켜서 cell 내용물들이 buffer안으로 녹아 나오게 하고, pellet은 제거한다. 그리고 그 상층액만을 모와서 glutathione-sepharose beads을 넣어주어서 GST-fusion proteins을 붙게 한 후, 침전시켜서 그 침전 된 것을 모아서 elution하여 GST-fusion proteins만을 모으면 된다. 더 나아가 cleavage단계를 거치면 원하는 recombinant proteins만을 얻을 수 있다.4. Determine points -Quality of Proteins일반적으로 GST는 26kDa이다. 예를 들어, GST을 tagging하고 있는 fusion proteins 자체가 14~15kDa이라하면, 일반적으로 이런 크기의 proteins은 purification하는데 보통 손쉽게 할 수 있다. 하지만포 안에서는 그것을 불용성으로 되게 만들어 버린다. 또한 단백질의 기본을 이루고 있는 amino acid sequences을 바탕으로 2차 구조는 그것의 solublity에 영향을 줄 수 있다.● 실험재료- BL2 E.coli, LB broth 5ml x 4 and 200ml x 4, ampicillin, Tag(fusion partner)-His tag Ni2+, GSH(glutathione-sepharose beads)* His-tag : 금속친화성 크로마토 그래피를 이용한 단백질 분리 정제에서 단백질 표면에 존재하는 histidine, cysteine과 같은 아미노산들과 Cu(2+), Ni(2+), Co(2+)와 같은 금속이온들과의 선택적 친화성을 이용한 것이다. 그런 다음 금속 이온과 결합한 후 pH를 낮추거나 imidazole을 사용하여 분리한다.- smaple : (4, 5, 6)- His tag으로, 7 cell - GSH로 ...● 실험방법- 200ml LB broth 4개를 만든다.- 5ml LB test tubes에 ampγ 5λ씩 넣고 4, 5, 6, 7 cell을 각각 seeding 한다(영목이) - 1 day- 200ml LB broth에 각각 amp 200λ(1:1000)씩 넣고 test tube에 키웠던 cell들을 pour 한다.- Incubating 37℃ about 1hr- inducer인 IPTG( Isopropyl β-D thiogalactoside)(실험실 입구 냉동고 윗 칸 in 빨간색 box) 1M 짜리를 1:2000 농도(500μM)로 넣기 즉, 100λ/200ml1000000(1M) : x = 2000 : 1 ∴ x = 500μM200000(200ml) : x = 2000 : 1 ∴ x = 100λ- 5~6시간 incubating 37℃ OD = 0. ~ 0.- 8000rpm for 20min centrifuge.- 상등액을 제거 후 냉동 보관한다.- Suspension buffer(PBS 20ml+PMSF200λ+, sonicator는 열이 발생하기 때문에 고열로인해 protein이 denature된다.Sonication할 때의 cell volume도 중요하다.(protocol 참조)※ About inclusion bodiesinclusion이 생기는 원인을 자세하게 분석하면서 실험 조건을 변화시켜 최종적으로 Optimizing for soluble expression을 정해야 한다. 일반적으로 High-level expression of foreign fusion proteins in E.coli은 종종 inclusion bodies을 형성 할 수 있다. Inclusion bodies는 folding intermediates에 실패되어 불용성으로 뭉치고 뭉친 것들이다. Inclusion bodies가 생기면 그 proteins을 solubilize와 refold 되도록 전략을 발전시켜야 된다. 다양한 배양의 parameters을 한가지 또는 여러 가지를 바꿔가면서 실험에 투자하면 soluble fraction에서 non-degraded fusion protein의 좋은 효율을 제공할 수 있다.* solubility을 높이도록 배양 온도를 낮춘다. ( 20℃~30℃ 범위안)* IPTG의 농도를 0.1 mM이하로 내려서 induction level을 바꾼다.* Induction 시간을 바꾸어 준다.* 좀더 짧은 시간 동안 induction을 해준다.* 높은 cell density에서 짧은 시간 동안 induction을 해준다.* rpm을 높여 aeration을 증가시킨다.* 위에서 말한 방법을 복합적으로 바꾸어 감에 따라서 최적을 배양 조건을 정한다.* Fusion proteins이 insoluble inclusion bodies로서 생산되어 진다면, translation의 속도를 저하시킬 수 있는 배양 조건으로 바꾸어 줘야 한다.* 만약 the plasmid를 E.coli strain BL21가 아닌 다른 host에서 증식을 했다면, fusion protein의 발현을

자연과학| 2010.06.08| 4페이지| 2,500원| 조회(850)

Protein, 분자생물학, 생명, 정제, purification, 단백질 정제

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Sanitizer treatment 효과

실험결과 보고서( 조)ㅇ 실험제목(Title) : Sanitizer treatment 효과ㅇ 서론(목적 및 실험원리와 이론)- 실험 목적(Objectives): 식품가공 공정에 있어서 가공 관련자의 위생이나 주변 도구는 항상 깨끗한 상태로 유지되어야 한다. 항상 손에 붙어있는 미생물이 손 씻는 방법에 따라서 세척, 제거되는 결과 (총 균수와 coliform)를 상호 비교해 봄으로써 그 중요성과 효과적인 세척방법을 인식한다.- 실험 원리 및 이론(Principles &Theory): 우리가 살고 있는 환경 (공기, 물, 토양 등)에는 수많은 종류의 미생물이 존재하고 있으며, 이들은 영양분, 수분활성, pH, 온도, 산소 등의 요인이 적절한 조건에서 성장한다.식품은 미생물에게 하나의 환경이다. 식품의 미생물에 의한 오염은 원료에서부터 오염되는 1차 오염과 가공 후에 오염되는 2차 오염으로 구분된다. 그러므로 가공 관련자의 손에서부터 나오는 미생물들은 식품의 1, 2차 미생물 오염 모두에 중요한 원인이 된다.총 균수와 coliform측정 실험을 수행하기 위해 PCA (Plate Count Agar)와 VRBA (Violet Red Bile agar)를 만든 후 수돗물, 찬 수돗물 세척액, 따뜻한 수돗물 세척액,비누 세척액을 배지에 배양하여 미생물 균수를 측정함으로써 효과적인 세척방법을 알 수 있다.① PCA(Plate Count Agar) - 표준한천배지: 대부분의 미생물이 자랄 수 있는 기본적인 영양성분을 함유하고 있는 배지(영양배지)로서 sample의 총 미생물의 균수를 측정하기 위해 사용하는 배지이다. PCA는 선별배지는 아니며 모든 균이 자랄 수 있는 환경을 가진 배지이다.0.5% peptone 0.25% yeast extract 0.1% glucose 1.5% agarpH adjusted to neutral at 25 C.② VRBA(Violet Red Bile Agar) - 대장균 군 감별배지: 보라색 Colony형성ㅇ 실험준비(시약 및 기구)? Sample : 손을 씻은 후 Swab을 하여 sample추출? 실험기기 : Petri-dish, Vortex mixer, Test tube, Incubator, Micro-pipette, Beaker, Peptone water, Water, Water bath(45°C), 비누, Alcohol lamp, 삼각플라스크, Swab? 시약 : PCA (Plate Count Agar), VRBA (Violet Red Bile agar)ㅇ 실험방법※ 주의사항1. Pipette filler를 사용할 때 시약의 역류를 주의한다. 만약 시약이 역류하여 filler안에 들어간다면 기기가 고장이 날 수 있다.2. 실험에서는 pouring을 하기 때문에 Agar가 액체 상태로 유지 되어있어야 하며, pouring시에 균이 사멸하지 않게 하기 위해 water bath 온도를 45°C로 유지한다)3. Water bath내에는 D.W(증류수)를 주로 사용하나 그냥 수돗물을 사용 할 수 있다. 가능한 D.W를 사용 하도록 한다.ㅇ 실험 결과① 1조 : Control(씻지 않은 손)(VRBA 결과) (PCA 결과=곰팡이확인)유효숫자 = 25~250, 30~300② 2조 : 찬물에 씻은 손③ 3조 : 따듯한 물에 씻은 손(VRBA 결과) (PCA 결과)유효숫자 = 25~250, 30~300④ 비누로 씻은 손 (사진 미 첨부)※ 최종 결과(PCA)CFU희석배수CFU / mlLog1조 (Control)1443-210144,3005.162조(찬물)985-21098,5004.993조(뜨거운물)338-21033,8004.534조(비눗물)541-21054,1004.73? Coliform을 확인하는 VRBA 실험에서는 Control에서 1개의 colony가 확인 되었고 나머지에서는 확인 할 수 없었다. 하지만 거의 대부분 coliform은 발견이 어렵다고 한다.? 총 균수를 확인하는 PCA에서는 유효숫자 = 25~250, 30~300를 모두 벗어난 값을 보였기에 더 많은 희석배율이 요구된다.또한, 예상과는 달리 4조(비눗물)에서 가장 적은 균이 확인 되어야 하나 3조 보다 많은 균이 확인 되었다.ㅇ Discussion이번 실험은 식품가공 공정에 있어서 가공 관련자의 위생이나 주변 도구는 항상 깨끗한 상태로 유지되어야 함에 있어 항상 손에 붙어있는 미생물이 손 씻는 방법에 따라서 세척, 제거되는 결과 (총 균수와 coliform)를 상호 비교해 봄으로써 그 중요성과 효과적인 세척방법을 인식하는 것에 목적을 둔 것이었다.결과 값을 통해 확인이 가능한데 이번실험에서는 Coliform의 존재를 확인하는 VRBA에서는 Control로 이용한 씻지 않은 손에서 1개의 coliform colony가 확인 되었다. 그 이외의 씻은 손은 발견이 되지 않았다. 조교님 말씀대로라면 coliform은 대부분 발견이 쉽지 않다고 하는데 예상대로라면 손을 오랫동안 씻지 않았거나 위생상태가 불량 또는 교차오염의 가능성을 보여준다.총 균수를 알아보는 PCA에서는 예상대로라면 미생물 수는 = 씻지 않은 손>찬물에 씻은 손>뜨거운 물에 씻은 손>비눗물에 씻은 손, 이러한 결과를 얻어야 한다. 하지만 실재 결과는 씻지 않은 손 > 찬물에 씻은 손 > 비눗물에 씻은 손 > 뜨거운 물에 씻은 손, 이러한 결과가 나왔다. 그 이유는 ① 실험 대상자가 4가지 모두 달랐다는 것이다. 하지만 4가지 실험을 하기위해서는 대상자가 같은 사람이고 같은 환경 조건이 이루어져야 하는데 실재로는 불가능 하다고 볼 수 있다. 또한 성에 따라서 그 차이가 나타날 수도 있기 때문이다. ② 손 세척시간의 미 측정에서도 볼 수 있다. 처음 실험 대상자가 1분동안 깨끗하게 씻었고 두 번째 대상자가 30초 밖에 씻지 않았다면 그 차이에 따라서 미생물의 잔류가 결정 될 수 있을 것이다.또한 아쉬웠던 점은 희석배수가 100배까지 라서 유효숫자 범위에 들지 않아서 정확한 값을 얻기 어려웠다는 점이다. 1000~10000배 정도까지 희석을 해 보아야 하지 않을까 생각해 본다.※ 식중독 예방(손 씻기 방법 및 효과)1. 손 씻기의 중요성 : 질병예방, 개인건강증진, 식품안전2. 피부(손)의 미생물① 상재균(residentflora)? Coagulase negative stap등? 피부의 깊은 층에 부착? 제거하기 어려움? 감염 발생과 관련이 적음② 오염균 (contaminant)? 그람음성 간균? 피부의 표피층에 부착? 환경이나 타인으로부터 오염

자연과학| 2010.06.08| 6페이지| 2,000원| 조회(247)

식품, 위생, 식품위생, 균수, Coliform, VRBA

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immunoprecipitation assay

실험결과 보고서( 조)ㅇ 실험제목(Title) : Immunoprecipitation assay(면역 침강법)ㅇ 서론(목적 및 실험원리와 이론)- 실험 목적(Objectives)① 항원-항체 반응에 대해 알아본다.② precipitation 현상을 이해하고 설명할 수 있어야 한다.③ 식품가공 현장에서 빠르고 신속하게 제품을 screening하여 식중독 세균의 오염여부를 확인할 수 있는 신속검출법의 방법인 면역 침강법에 대해 알아본다.- 실험 원리 및 이론(Principles &Theory)1. 현재 식품 중 위해미생물 검출을 위한 방법으로는 증균, 선택배지 배양 및 선택성을 나타내는 집락에 대한 유전적?생화학적 특성검사로 이루어지고 있다. 그러나 이러한 표준 미생물 검사방법은 균을 동정하기까지 시간이 다소 오래 소요되고 노동력이 많이 필요한 단점이 있다.특히 식품산업 현장에서 표준 미생물 검사방법으로 검사하는 것은 많은 경비와 시간이 소요된다는 점에서 사용에 여러 가지 제한이 따를 수밖에 없다. 현재 미생물의 특성을 이용한 다양한 신속검출방법이 개발되어 상용화되고 있다. 그러나 정확성과 신속성을 모두 만족시키기에는 검출력에 있어 아직까지 한계를 보이고 있는 실정이다. 따라서 현장에서 바로 적용할 수 있는 신속하면서도 정확성이 뒷받침되는 검출방법 개발은 반드시 필요하다고 볼 수 있다.2. 면역 침강법(immunoprecipitation): 면역 침강법은 물에 녹아서 침전이 형성되지 않는 항원을 항체를 이용하여 항원-항체 복합체의 침전을 형성하게 하여 항원의 존재를 확인하는 방법이다. 이 방법은 일반적으로 단백질과 같은 수용성 항원을 확인 할 때 이용된다.침전의 형성은 항원이 너무 많거나 항체가 너무 많아도 형성되지 않으며, 언제나 항원과 항체의 역가가 일치하는 등가의 지역 (zone of equivalence)에서 얻어진다. 그러므로 용액상태에서 침전을 얻고자 할 때에는 항원-항체의 등가의 지역이 어디인지 예비실험을 통하여 확인하여야 한다. 일반적으로 등가의 지역은 항원이나 항체의 농도를 달리하여 반응시키고 침전의 생성유무를 확인함으로서 구할 수 있다.( 용액상태의 면역 침전법)3. VIP Kit(美, Bio Control System, Inc)① E.coli O157:H7, Listeria를 24hr내에 감별, 정성 가능한 신속한 screening(식중독의 유, 무 만을 판정)② 원리 : 증균배양한 검체 배양액 중 세균은 특이적 항원으로 작용하여 시약과 반응하여, 항원-항체-크로모젠 복합체가 생성되면서 착색되어 결과판정 가능.③ 사용법- 시료25g + 증균배지 225ml 취하여 증균 배양 후(리스테리아는 2차배양까지) 최종배양액 0.1ml를 검사카드의 주입구에 떨어뜨린 후 10분간 방치- 판정 : 세로 표시선이 2개 나타나면 양성 세로 표시선이 1개만 나타나면 음성④ 특징3- 증균 배양(필요한 최소미생물 수는 10 ) 후 바로 결과 판정 가능- 리스테리아 및 O157:H7과 같은 항원을 지닌 균주에 대하여는 특이성이 없음ㅇ 실험준비(시약 및 기구)? Sample : 임의의 균을 접종한 식품(햄, 돼지고기) - E. coli O157:H7, Salmonella spp.? 실험기기 : micro pipette, 신속검출키트-VIP kit(E. coli O157:H7 Test System),멸균 팁, 알코올 램프, Stomacher bagㅇ 실험방법※ 주의사항1. Pipette 사용시 천천히 사용한다. 시료의 역류 시 기기 손상가능 또한, 시료의 오차가 발생 할 수 있다.2. 식중독 균을 다루기 때문에 hand washing과 소독을 철저히 한다.3. 실험 실시 후 20min이 초과 하지 않도록 유의한다.(결과 오차가 발생할 수 있다.)ㅇ 실험 결과(E. coli O157:H7) 확인(E. coli O157:H7) 확인ㅇ Discussion이번실험은 식품가공 현장에서 빠르고 신속하게 제품을 screening하여 식중독세균의 오염여부를 확인할 수 있는 신속검출법의 한 종류인 Immunoprecipitation assay(면역 침강법)에 대해 실습해 보았다. 실험법은 간단했다. VIP kit(E. coli O157:H7 Test System)를 이용하여 식품 내 임의의 균을 접종하여 어떤 식품에 E. coli O157:H7이 있는지 확인 하는 것이다.시간은 15min~20min정도를 반응 하여 확인해야 하며, 그 시간이 초과할 시 에는 오류의 발생가능성이 높아지므로 주의해야 한다. 결과 확인은 검정색 띠가 2개 생기면 (+)으로 E. coli O157:H7이 있는 식품이며, 1개 생기면 (-)로서 E. coli O157:H7가 없는 식품이다.결과 확인은 A식품에서는 2개의 띠가 확인되었기 때문에 E. coli O157:H7가 있는 식품이다. 두 번째 B식품에서는 1개의 띠(Control indicater-유효성 검증)만 확인되었음으로 negative이었다. 마지막으로 세 번째 C식품에는 희미하게 보였지만 2개의 띠를 확인 할 수 있었기에 E. coli O157:H7가 있는 식품으로 판정되었다.과제)여기에서 첫 번째 띠는 kit에서 중요한 의미로 작용하지 않는다. 단지 유효성 검증만을 확인하는 Control indicator로서 균의 유무 정도만을 확인 하게 해주는 작용이다. 여기에서 중점을 둬야하는 부분은 두 번째 띠의 확인이다. 그렇다면 두 번째 띠가 주는 중요성이 어떤 것인지, 또한 만약 우리가 직접 이러한 kit를 개발하고 상용화시키기 위해서 중점을 둬야하는 부분은 어디인지 생각해 본다.우선 대부분의 신속검출법은 그 방법이 매우 간단하고 빠르게 확인 검출이 가능하다는 장점을 가지고 있지만 그런 만큼 고가의 상품이다. 그러므로 여기서 중점을 둬야 할 부분은 가격의 저렴화에 있다. 그러기에 앞서 kit가 만들어 질 수 있는 기본 개념에 대해 우선 생각해 보아야 할 것이다.※ Screening Step : 환경이나 식품중에 존재하는 여러 미생물 중 Target M/O의 존재 유무를 밝혀내는 것을 주목적으로 한다. 병원성미생물의 경우에는 Screening의 확률을 높이기 위한 전단계로 Enrichment step을 도입한다. 이러한 Enrichment step의 주목적은 Injured cell의 revival 및 cell growth를 목적으로 한다.이러한 Screening단계에서 주의해야할 점은 False Positive와 False Negative result를 얻는 것이다.1. 식품 내에 어떠한 균의 유, 무 존재를 알기위해서는 specific한 균에 대한 specific한 항체를 찾아야 한다.→ 예를 들면 우리가 알고자하는 것은 식중독을 일으키는 균(E. coli O157:H7)이 있는지에 대한 것인데 막연하게 E. coli O157만 확인 하는 균이면 의미가 없게 되는 것이다.이러한 오류는 다음에서 설명하는 두 가지로 요약 해 볼 수 있다.① false positive : 말 그대로 실제로는 양성(+)이 아닌데 결과적으로 양성(+)이 나온다는 뜻이다.환경이나 식품중에 존재하는 미생물들은 다양한 미생물들이 혼재되어 있어 미생물간의 Inter-action에 의한 side - rxn이 발생하는 경우, Citrobacter나 Salmonell와 같이 유사한 특성을 나타내는 미생물에 의해 False positve 의 결과를 얻는 경우도 있다. 주로 Biochemical 원리를 이용하여 검출할 때 자주 발생되는 경우이다.예를 들자면 어떤 정보가 옳은지 틀린지를 결정하기 위해 어떤 검사를 했다. 그런데 '실제로 그 정보가 틀린 것(-)인데 검사 결과에서는 옳다고(+)'나왔다면 그것을 false positive(위양성)이라고 한다.(즉, E. coli O157:H7를 확인 하려했는데 E. coli O157전체를 확인하는 항체였다면 그 결과는 (+) 있다고 확인 되는 것이다.)② false negative : 반대로 '실제로 그 정보가 옳은데도(+) 검사 결과에서는 틀리다고(-)'나오게 되는 것이다.

자연과학| 2010.06.08| 5페이지| 2,000원| 조회(791)

식품, 위생, 양성, 식품위생, O157, 검사 결과

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실험결과 보고서( 조)ㅇ 실험제목(Title) : Catalase Test(식중독 균-S.aureus 의 생화학 테스트)ㅇ 서론(목적 및 실험원리와 이론)- 실험 목적(Objectives)① 효율적인 세균성 식중독의 관리를 위해서는 무엇보다도 식중독 세균의 검출과 screening이 중요하다. 이 실험에서는 식품에서의 식중독 세균을 검출하여 분리, 동정, 확인 시험에 있어서 생화학 테스트를 직접 실행본다.② 생화학적 실험을 통해 Gram(+),(-)균인지 판정할 수 있다.③ 실험에 이용되는 원리에 대해 이해한다.- 실험 원리 및 이론(Principles &Theory)포도상 구균(Staphylococcus)은 Micrococcaceae과에 속하며, 현미경으로 보면 포도송이와 같이 연속된 균체를 형성하는 그람양성 통성혐기성 구균(직경 0.8∼1.0㎛)으로 현재 23종 4아종으로 분류되어 있다. 이중에서 황색포도상구균(Staphylococcus aureus)은 식중독을 포함하여 여러 가지 감염증을 일으키는 가장 중요한 균종이며, 다른 균종은 기회 감염균이다.cf) 기회 감염균(Opportunistic pathogen)이란??기회 감염균 (Opportunistic pathogen)이란 건강한 사람에게는 큰 문제가 없으나 노인이나 어린이 또는 급성백혈병, 당뇨병, 암 등의 질환으로 면역력이 약해진 사람에게 폐질환 및 육아종, 외이도염, 아스퍼질루스증 등의 질환을 일으키는 미생물(아스퍼질러스균, 페니실륨균, 폐렴구균 등)을 일컫는다.사람에게 식중독을 일으키는 것은 1균군의 황색 포도상구균(S. aureus subsp aureus)으로 코아굴라제 생산성을 가지고 있으며, 이 성상은 이 균의 동정에 중요한 열쇠가 되고 있다.※ 코아굴라제 양성균S. intermedius, S. delphini, S. schleiferi subsp. coagulans 및 S. hyicus가 있다. 이들 균종 중 장독소를 생산하는 것으로는 S. aureus 이외에 S. intermedius 와 S. hyicus가 보고되어 있으나 이 균종에 의한 식중독은 발견되지 않았다.♤ Catalase Test· Hydrogen peroxide는 호기성 당 분해 산화과정의 최종산물로서 세포 독성작용이 있으므로 세포내에 축적되면 세포가 죽게 된다. 그러므로 세균들은 catalase나 peroxidase를 이용하여 hydrogen peroxide를 분해한다.· 일부 세균은 Iron을 함유하지 않는 catalase를 가지고 있으며 이러한 catalase를pseudocatalase라 한다. 전형적인 catalase 효소는 과산화수소를 가수분해하고 산에 강하나 pseudocatalase는 산에 약하다. Catalase는 대부분의 cytochrome을 함유한 호기성 및 통성 혐기성 세균에 존재하지만 연쇄구균을 포함한 일부 균종에는 없다.· Catalase 효소는 Hydrogen peroxide를 가수분해하여 물과 산소를 만들며 cytochrome system이 없는 세균의 대부분은 catalase 효소가 없으므로 과산화수소를 가수분해하지 못한다.· 대부분의 혐기성 세균은 catalase 대신에 peroxidase 효소를 가지고 있으므로 혐기성 세균에서의 catalase 시험은 peroxidase에 의해 간섭 영향을 받을 수 있기 때문에 비 특이적인 시험방법이다.※ 이용Positive(기포발생)Negative(기포발생 X)Micrococcus/StaphylococcusBacillusListeria monocytogenes/CorynebacteriumStreptococciClostridiumErysipelothrix① 균속 또는 과의 감별 분류② 균 동정· 결핵균 동정시험ㅇ 실험준비(시약 및 기구)? Sample(균) : S.aureus, E.coli (Streaking 배양)? 시약 : 3% H2O2(Hydrogen peroxide)ㅇ 실험방법※ 주의사항① 오염된 과산화수소나 오래된 과산화수소인지 확인 후 사용한다.② Catalase test시에 plate에 해도 무방하나 catalase활성이 없다면 균은 죽게 되므로 culture한 균을 계속 사용할 것이라면 plate에서 따서 하도록 하고, test만 하고 필요없다면 plate에 바로해도 무방하다.ㅇ 실험 결과(1조실험 plate 참조함)→ 실험결과 각조마다 각각2개의 plate가 주어졌고, 각각 양성균(빠른 기포형성)과 음성균(느린기포형성)이 1개씩 확인되었다. 여기서 양성균은 식중독균인 S.aureus이었으며, 음성균은 E.coli로 판정되었다.ㅇ Discussion이번실험은 식품에서의 식중독 세균을 검출하여 분리, 동정, 확인하는 생화학 test중에서 어떤 특정미생물이 Gram(+)인지 (-)균인지 판정할 수 있는 catalase test실험을 수행하였다.실험의 간단한 원리는Catalase2H2O2 --------------> 2H2O + O2↑Hydrogen peroxide는 호기성 당분해 산화과정의 최종산물로서 세포 독성작용이 있으므로 세포내에 축적되면 세포가 죽게 된다. 그러므로 세균들은 catalase이용하여 hydrogen peroxide를 분해한다.Catalase는 hemoprotein으로서 한 분자당 3가 철이온 (Fe+++)이 4개가 있으며 효소활성시에는 산화 상태로 존재한다. 전형적인 catalase 효소는 과산화수소를 가수분해한다. Catalase는 대부분의 cytochrome을 함유한 호기성 및 통성 혐기성 세균에 존재하지만 연쇄구균을 포함한 일부 균종에는 없다. Catalase 효소는 Hydrogen peroxide를 가수분해하여 물과 산소를 만들며 cytochrome system이 없는 세균의 대부분은 catalase 효소가 없으므로 과산화수소를 가수분해하지 못한다.대부분의 혐기성 세균은 catalase 대신에 peroxidase 효소를 가지고 있으므로 혐기성 세균에서의 catalase 시험은 peroxidase에 의해 간섭 영향을 받을 수 있기 때문에 비 특이적인 시험방법이다.즉, 이 실험에서 기포(O2)가 발생하면 양성균, 기포가 원래 형성을 하지 않으면 음성균으로 판명된다.· Catalase 존재 : Bubble of free oxygen 생산 -----> Catalase - positive· Catalase 존재 X : Bubble of free oxygen 생산 X -----> Catalase ? negative※ Catalase에 양성 or 음성 균Positive(기포발생)Negative(기포발생 X)(포도상구균)Micrococcus/StaphylococcusBacillusListeria monocytogenes/Corynebacterium(연쇄상구균)StreptococcusClostridiumErysipelothrixCorynebacterium pyogenesCorynebacterium haemolyticum※과산화 수소를 떨어뜨렸을때 Catalase를 생산하여 물과 산소기체를 발생시켰다면 양성균으로 판명하며, catalase활성이 없다면 기포가 발생하기 않고 이는 음성균으로 판명한다. 또한 과산화수소는 toxic하므로 균은 죽게 된다. 여기서 시간이 경과한 후 발생하는 기포의 경우는 cell이 catalase활성을 가지고 있기 보다는 사멸된 것으로 볼 수 있다.

자연과학| 2010.06.08| 5페이지| 2,000원| 조회(1,120)

식품, 기체, 위생, 식품위생, 세포사멸, 양성균

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실험결과 보고서( 조)학번 : 실험 일시 : 2008년 9월 11일 (목) 실험자 :ㅇ 실험제목(Title) : 환경 샘플링ㅇ 서론(목적 및 실험원리와 이론)- 실험 목적(Objectives)① 식품산업에 있어서 가장 중요한 과제중 하나인 식품의 안정성에 대해 알아본다.② 식품과 접촉하는 조리기구&기기, 식품제조와 기구세척에 사용하는 용수, 공기, 작업장 환경 등의 위생관리에 관여하여 우리 주변 환경에서 Sampling을 하여 위생 정도를 알아본다.③ 사용하는 Agar 배지를 달리하여 균의 종류를 확인해 봄으로서 우리주변의 위생 상태를 직시해보고 위생의 중요성을 인식한다.- 실험 원리 및 이론(Principles &Theory)1. 배지(Culture medium)- 미생물 생장에 필요한 영양소를 충분히 넣고 적당한 삼투압과 pH를 조절하여 만든 미생물의 배양 물질로 인공적인 증식환경을 말한다.- 121°C, 15min간 멸균하여 사용한다.- 배양목적에 따라 다양하게 제조하며, 미생물의 특성을 고려하여 적절하게 이용한다.① PCA(Plate Count Agar) - 표준한천배지: 대부분의 미생물이 자랄 수 있는 기본적인 영양성분을 함유하고 있는 배지(영양배지)로서 sample의 총 미생물의 균수를 측정하기 위해 사용하는 배지이다. PCA는 선별배지는 아니며 모든 균이 자랄 수 있는 환경을 가진 배지이다.0.5% peptone 0.25% yeast extract 0.1% glucose 1.5% agarpH adjusted to neutral at 25 C.② EMB(Eosin Methylene Blue Agar) - Gram(-)간균 분리의 감별배지: 감별배지(Differential medium)의 방법으로서 같은 Slide plate에 자라고 있는 미생물 중에서 특정한 Colony를 다른 colony와 구별하는 데 이용하는 방법으로서 영양배지에서 젖당(lactose)을 발효하여 산을 생성하는 균(E.coli)은 금속성의 광택이 나는 청록색의 colony형성, 젖산을 생성하지 못하는 세균과 쉽게 구별 가능한 배지이다.* 이번 실험에서는 대장균의 구별을 위해 사용한다. 대장균의 색은 청록색을 띄게 된다.③ VRBA(Violet Red Bile Agar) - 대장균 군 감별배지: 대장균 군(coliforms)은 그람음성 무아포성 간균으로, 유당을 분해하여 산과 가스를 생산하는 호기성 및 통성혐기성 균을 말한다. 자연계에 널리 분포되어 있고, 환경 위생 관리의 척도를 나타내는 ‘오염지표균’이라고도 한다. 이러한 대장균 군을 판별 할 수 있는 평판 배지 법 중 하나로 암적색집락을 형성을 하게 되는데 장파장의 자외선 조사 하에 형광을 나타내는 집락을 산출한다.ㅇ 실험준비(시약 및 기구)? Sample : 손(hand) Swab sample, 토양(과학도서관 앞 채취)? 시약 : Peptone 수, Plate Count Agar(PCA), Eosin Methylene Blue Agar(EMB), Violet Red Bile Agar(VRBA)? 기기 : 알코올램프, pipette, Tip, Swab, Spreaderㅇ 실험방법① PCA, EMB, VRBA를 제조한다.② Sample 준비③ 배지 접종 후 Spreading실시.※ 실험실시 희석배율손토양PCA-1 -210 10-3 -4 -510 10 10EMB-1 -210 10-2 -310 10VRBA-1 -210 10-2 -310 10※ 주의사항1. 시료의 Sampling은 1/10희석한 것이기 때문에 반드시 균수 측정시 10을 곱하셔 환산한다.2. 실험은 미생물을 다루는 실험으로서 멸균을 철저히 하여 오염되지 않도록 한다.ㅇ 실험 결과※ 균수측정방법Cell Counting × 희석배율 ×10(sampling 희석배율 1/10) CFU/mL유효숫자=30~300 or 25~250손토양-110-210-210-310-410-510PCA20320EMB0E.coli colony 미발견잡균(검정 colony)잡균(검정 colony)VRBA0000Ex) PCA 10배 희석 2개 colony2×10×10=200 CFU/mLㅇ Discussion이번주는 식품위생실험의 첫 실험으로서 가장 기본적으로 식품과 직접적으로 접촉하는 조리기구&기기, 식품제조와 기구세척에 사용하는 용수, 공기, 작업장 환경 등의 위생관리에 관여하여 우리 주변 환경에서 Sampling을 하여 식품이 미생물에 얼마나 안전한지, 어느 정도 노출이 되어있으며, 어느 미생물에 가장 쉽게 노출이 될 수 있는지를 알아보는 실험 이었다.그러기 위해 Sampling을 식품을 가장 기본적으로 다루는 손과 주변의 토양을 이용함으로서 어떤 종류의 미생물이 존재하는가하는 선별배지사용, 얼마나 많은 균에 노출되어있는지 단순 균의 존재여부를 알 수 있는 PCA배지를 이용하였다.결론부터 말하자면 손에서는 비록 유효숫자인 30~300개 범위에 들어오지는 않았지만 약 200마리의 종류를 알 수 없는 미생물이 있다는 것을 결과를 보고 도출해 내었다. 또한 손에 대장균의 생장 유무를 알기위한 EMB배지에서는 10배 희석에서는 자라지 않았지만 100배 희석에서 E.coli가 아닌 잡균이 자란 걸 확인 할 수 있었다. 그리고 대장균 군을 판별하기위한 VRBA배지에서는 아무런 균도 발견할 수 없었다. 실험에서 아이러니 하게도 10배 희석에서는 아무것도 자라지 않았지만 100배 희석에서는 잡균이 자랐다는 것은 예상하건데 실험 과정 중에 Tip이나 기타 기기 등에서 오염이 되었을 거라는 것과, Sampling을 할 때 균을 희석함에 있어서 충분히 Mixing을 해주어야 하지만 실험 여건상 그러지 못했기 때문에 균이 충분히 희석이 되지 않고 덩어리 져서 돌아다니는 상황에서 그 부분을 이용해서 spreading했을 거라는 추측을 해본다.토양에서역시 손에서의 결과와 비슷한 결론을 얻어 낼 수 있었다. 단순히 균의 생장을 관찰하는 PCA에서는 유효숫자에 들어오지 않은 결과였고, 역시나 희석배율에 따른 결과는 얻을 수 없었다. E. coli의 존재 여부를 확인하는 EMB배지역시 손에서와 같이 잡균의 검정색 colony가 확인 되었다. 대장균 군을 모두 확인할 수 있는 VRBA배지에선 전혀 자라지 않았다. 결과적으로 보면 E.coli 등의 식중독을 일으킬 수 있는 대장균들은 없었다는 것이다. 왜 희석배율에 맞게 결과가 나오지 않았을까 하는 의문은 vortexing의 미 실시에서 잘 희석되지 않았을 것이라는 것과, 더 낮은 희석배율에서 결과 값을 얻을 수 있을거라는 추측이다. 그렇게 생각해 보면 토양은 1/10과 1/100배로 희석한 값에서 확인이 가능할 것이라 생각된다.여기에 더하여 궁금한 점은 실험 중에도 질문을 드렸지만 sampling이 1/10로 희석된 상태에서 10배 100배 실험을 실시했다고는 하지만 실재적으로는 100배 1000배로 희석한 후 실험을 실시해서 나중에 10을 더 곱한 다음에 그 결과 값을 환산했는데 이론상으로는 맞는 것이긴 하나 제가 타 실험을 해봄으로서 얻었던 결과들은 아무리 10배 100배 희석을 했다고 100배에서 10개 나오던 colony가 10배 희석한 곳에서 그것의 10배인 100개가 나온다고 보장할 수 없다는 점입니다. 어떠한 경우 100배에서는 아무 것도 나오지 않았는데 10배에서 5개(유효숫자에 들어가진 않지만)가 나왔다고 그 결과가 50CFU/ml이라고 결정 할 수 있느냐 하는 것입니다. 이렇게 딱 들어맞는다면 정말 운이 좋다고 보는 경우가 많았는데 이번실험에선 제 생각이라면 10배를 spreading 해야 하지만 실재적으로는 100배 희석하여 spreading하여 나중에 10을 곱해서 그 값을 도출해 낸다는 점에 납득이 가질 않습니다. 굳이 실험을 해야 했다면 오래 걸리더라도 sampling(1/10로 희석된)을 1ml딴 다음 spreading해야 했지 않나 싶습니다. 결과는 손에 미생물이 극히 적어서 유효숫자에 걸리지 않는 값이었지만 작은 저의 궁금함 이었습니다.^^

자연과학| 2009.06.02| 4페이지| 2,000원| 조회(607)

삼투압, 식품공학실험, 위해요소실험, 영양배지

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