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RNA isolation RT-PCR

RNA isolation & RT-PCR1) RNA isolationMATERIALSTRIZOL, Chloroform, Isopropanol, 70% Ice-cold EtOH, DEPC-treated WaterPROCEDURE- remove the media- Add 500 ul of TRIZOL and pipet the lysate up and down- Transfer the sample to a e-tube ///////////store at -70°C- Add 100 ul of chloroform- Centrifuge the samples for 13000 rpm, 4°C, 15 min(Separate as: lower- clear pink , interphase- white, upper- clear aqueous)- Transfer the clear aqueous phase to a new tube- Add same volume of isopropanol- keep in -20°C for over 30 min ///////////store at -20°C- Centrifuge the samples for 13000 rpm, 4°C, 10 min- Discard the supernatant- Wash with 1 ml of 70% EtOH- Centrifuge the samples for 10000 rpm, 4°C, 5 min- Discard the supernatant- Air dry the RNA pellet for 10 min- Resuspend the RNA pellet in 20–50 µL of DEPC-treated Water- Incubate the RNA sample at 55°C for 10 min- Determine the RNA yield using nanodrop (260 nm/ 280 nm; RNA purity 1.8~2.0)2) RT-PCRMATERIALSFor RT: RNA sample, TOPscript RT DryMIX (strip tube), Pure WaterFor PCR: cDNA, Primer set, PCR Mixture, Pure waterPROCEDURERT:Add water and 5 ug of isolated RNA to RT strip tube (total 20 ul)Run thermocycler- 42°C for 5 min- 42~60 °C for 60 min- 95°C for 5 min- CoolingPCR:Add AccuPower PCR PreMix, primer, cDNA and water to strip tube (total 20 ul)PCR premix 10 ulPrimer F 0.5 ulPrimer R 0.5 ulcDNA 2 ulWater 7 ulTotal 20 ulRun thermocycler with saved file

자연과학| 2019.06.26| 2페이지| 1,000원| 조회(413)

RT-PCR, RNA 분리, RNA isolation

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Immunofluorescence staining

MATERIALSChamber slide, PBS, 4% paraformaldehyde, 0.2% triton x-100, 1% BSA in PBS, primary antibody, secondary antibody, Hoechst33342 or DAPI, mounting soln.PROCEDURE- Count the cells and plating cells on each well of chamber slide (make single cell!)- Allow 24 hours for the cells to attachment

자연과학| 2019.06.26| 1페이지| 1,000원| 조회(152)

staining, materials, Immunofluorescence

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PI staining (cell cycle and sub G1)

PI staining (cell cycle and sub G1)MATERIALSTrypsin, PBS, 100% Ice-cold EtOH, RNase A, PI→ RNase A (Sigma R4875): dilute in autoclaved water (stock- 50 mg/ml)→ PI (Sigma P4170): dilute in 0.1% sodium citrate buffer, pH 8.5 (Sigma S4641) (stock- 2.5 mg/ml)PROCEDURE- remove the media- Add 500 ul of Trypsin and incubate in RT for 3 min- Wash with 1000 ul of PBS- Transfer the sample to e-tube- Centrifuge the sample for 5 min- Discard the supernatant- Add 100 ul of PBS and pipetting well- Add 400 ul of 100% Ice-cold EtOH (using vortex and dropping)- keep in 4°C for over 30 min ///////////store at 4°C- Centrifuge the sample for 5 min- Discard the supernatant- Pipetting with 200 ul of RNase A (as final 100 ug/ml) and incubate in 37°C, 20 min- Add 200 ul of PI (as final 50 ug/ml) and inverting ///////////store at 4°C- Transfer to the FACS tube and analysis with FACS machine

자연과학| 2019.06.26| 1페이지| 1,000원| 조회(192)

Cell cycle, Propidium iodide, sub G1

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단일클론항체 생산원리

::항체유전공학::단일클론 항체 생산 원리- 단일클론 항체 생산 원리 -항체는 일반적으로 외부 물질(주로 단백질)을 생물체 내에 주입, 체액성 면역 반응을 유도하여 그 외부 물질(이를 항원이라 함)에 대한 항체 생성을 유도하고, 혈액 채취를 통하여 얻게 된다. 이러한 방법으로 얻은 항체는 대개 다클론 항체(polyclonal antibody)이다.체액성 면역반응에서 항원은 여러 가지의 항원 제시 세포(antigen presentingcell; APC)에 의하여 작은 조각 에피토프(epitope)으로 B cell에 제시되게 (presenting) 되고 B cell을 활성화시킨다. B cell은 이러한 활성 과정에서 항체를 만드는 전체 유전자 가운데 항원에 반응할 수 있는 항체를 만드는 유전자만이 재배열 되고 나머지 불필요한 유전자는 제거되어 한 가지의 항체 만을 다량으로 생성하여 세포 외로 분비하는 플라즈마 세포(plasma cell)로 분화한다. 항원은 일반적으로 여러 개의 에피토프를 가지므로 분화된 플라즈마 세포도 여러 종류이며, 따라서 생성되는 항체도 여러가지이다. 이렇게 여러 종류의 플라즈마 세포(즉, 항체를 만드는 유전자 자체가 각각 다른 경우)에서 분비된 여러 종류의 항체 전체 집합을 “다클론 항체”라 하며, 한 종류의 플라즈마 세포에서 만들어진 한 종류의 항체만을 “단일클론 항체”라 한다.1975년 이전의 면역 반응 연구는 하나의 항원에 대해서 면역계는 여러 가지 항체를 생성하며 이중 일부만이 항원을 인식하고 반응하는 다클론 항체에 기초하였다. 즉, 마우스에 특정 단백질을 주입하면 생쥐의 면역 시스템이 작동하여 각종 항체를 생성해낸다. 그 항체와 항원을 화학 물질을 사용하여 추출함으로써 면역 백신을 개발해 왔다. 그러나, 특정 항원에 대한 특이성이 낮고 순도, 효능 등이 떨어져 그다지 효율적인 면역제를 개발하기 어렵고 생산성 또한 낮았기 때문에 비경제적이었다. 그러나, 1975년 영국의 국립 의학 연구원 소속 Kohler 및 Milstein에 의해하이브리도마 세포(hybridoma cell)로부터 단일클론 항체를 만들어 내는 기술을 개발되었다. Hybridoma cell는 B cell과 악성 종양세포를 PEG(polyethylene glycol)와 같은 화합물로 처리하여 두 세포를 융합하여 만든 세포로 배양 기구에서 영구적으로 배양할 수 있어서 특정 항체만을 계속 만들어 낼 수 있었다. 이 항체는 또 항원의 특정 부위를 특이적으로 인식하는 능력을 가지는 항체를 대량 생산하는 방법을 제공함으로써, 고도의 특이성과 친화도를 가진 높은 순도의 항체를 만들 수 있어 면역 반응 및 관련 연구에 일대 전환점을 가져왔다.단일클론 항체는 항원의 세표 표면을 인식하는 부위인 에피토프에 특이적으로 반응하므로 특정 단백질을 분리하거나 동정할 수 있었다. 그리하여 단일클론 항체 기술은 특정 항원의 존재, 에피토프 및 항원간의 교차반응 연구에 중요한 도구로 사용되어 왔다.원하는 항원에만 특이적으로 반응하는 단일 클론 항체를 생산하기 위해서는 그 항원에 의해 면역화된 실험용 동물의 비장이나 림프절에서 B 세포를 분리하여야 한다. 이 분리된 B세포는 불멸성을 가지는 악성 종양 세포등과 PEG, 전기충격, virus이용 등의 방법을 사용하여 융합시키고 HAT 배지에서 배양시킨다. B세포와 의 융합에 골수종 세포(myeloma cell)가 적합한 이유는 다른 세포들보다 안정적인 하이브리도마를 형성하기 때문이다. 골수종세포가 항체를 생성하는 능력이 없고, 불멸성을 가지며, HGPRT(Hypoxanthine-guanine phosphoribosyltransferase)와 TK(Thymidine kinase)에 저항성이 없는 특징을 가짐으로 인해 융합된 세포만이 HAT배지에서 성장이 가능한 것이다.플라즈마 세포의 항체 생산 능력과 체액성 암세포주인 골수종 세포(myeloma cell)의 불멸화(immortality) 능력을 두 세포의 융합에 의하여 동시에 얻고자 고안되었다. 세포융합은 Sendai 바이러스나 PEG를 이용하여 이루어지며 두 세포가 성공적으로 융합되었다면, 그 융합된 hybridoma는 항체 생산 능력과 immortality를 동시에 갖는다. 이 과정에서 세포 융합은 반드시 다른 종류의 세포를 선택하여 일어나는 것이 아니라 같은 종류의 세포 사이에서, 혹은 2개 이상의 세포 사이에서도 일어나므로 반드시 두 종류의 다른 세포 사이에서 만들어진 hybridoma를 선택하는 과정이 수행되어야 한다. 이를 위하여 HAT(hypoxanthine, aminopterin, thymidine) 배지를 이용한 선택과정이 수행되며 사용되는 골수종 세포주는 반드시 Ab (-), HGPRT (hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase) (-)의 성질을 가지는 것이 사용되어야 한다 (ATCC의 SP2/0-Ag14 세포주). 즉, 골수종 세포 자체에 의하여 만들어지는 항체가 없어서 만들어진 hybridoma가 원하지 않는 항체를 생산하지 않아야 하고, HGPRT 효소의 기능이 없어야 한다.포유류의 세포는 DNA 합성 시 두 가지의 경로를 사용하는데, 하나는 de novo pathway이고 다른 하나는 salvage pathway이다. de novo pathway에서 PRT (phosphoribosyl pyrophosphate)는 THF(tetrahydrofolate)에 의하여 methyl 혹은 formyl기를 받아 uridine과 결합, 핵산염기의 기본구조를 만드는데, HAT 배지의 aminopterin은 THF와 유사한 구조를 가져 이 과정을 억제한다. 따라서 HAT 배지에서는 이 경로를 통한 핵산의 생합성이 일어날 수 없다. 곧 세포는 salvage pathway를 사용하여야 하는데, 이 경로에서 hypoxanthine과 thymidine이 결합하여 핵산염기를 만드는데 관여하는 효소가 HGPRT이다. 따라서 사용하는 골수종 세포는 이 경로를 통하여 핵산을 만들 수 없다. 즉, 플라즈마 세포만의 융합체는 자체의 mortality에 의하여 죽게되고 골수종 세포만의 융합체는 핵산 합성이 억제되므로 죽게 된다. 따라서 이 배지에서 생존 가능한 세포는 두 종류의 세포의 융합체 만이 살게 된다. 초기에 이 융합체는 원래의 두 배수 이상의 염색체를 가지므로 매우 불안정하며, 세포분열을 거치는 동안 본래의 염색체 수를 가지기 위하여 계속적으로 유전자를 제거해 나간다. 이 과정에서 생존에 필수적인 유전자가 제거되면 hybridoma는 죽으며, 항체 생산에 관련된 유전자를 제거하여 항체를 생산하지 않는 세포가 되기도 하므로 형성된 hybridoma의 유용한 항체생산 여부를 조사하여야 한다. Hybridoma는 집락(colony)을 형성하며 자라는데, 이는 다른 세포들이 모두 죽어버리므로 확인할 수 있다. 그러나 이 hybridoma는 아직 한 종류로 분리된 것이 아니므로 96 well plate 등을 이용하여 limiting dilution의 방법으로 well 하나 당 한개의 hybridoma cell이 들어가도록 배양하여 분리하여야 하며, 항체의 반응성은 일반적으로 ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay)로 조사하여야 한다.

자연과학| 2011.06.10| 5페이지| 1,000원| 조회(1,341)

유전공학, 항체, 단일클론항체

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[기독교]니고데모의 안경 평가A+최고예요

세계, 세계관 그리고 문화우리가 살고 있는 세계는 하나다. 그리고 모든 사람들은 하나의 세계에서 살고 있다. 그러나 하나의 세계에 살고 있다고 해서 모든 사람이 세계에 대해서 동일하게 인식한다는 것은 아니다. 사람들은 자신들이 자라온 개인적인 환경, 사회적인 환경에 따라 세상에 대해 각각 다르고 독특하게 인식한다. 곧 사람들이 저마다의 세계관을 가지고 있다는 것이다. 사람들은 끊임없이 세상에 대해서, 삶에 대해서 질문을 던지고 답을 구하면서 세계관을 형성해 온 것이다. 세계관에는 두 가지의 중요한 요소가 있는데, 하나는 세상과 삶에 대한 조망이고 다른 하나는 세상과 삶을 위한 조망이다. 이것을 다시 말하면 세상과 삶에 대한 이해와 비전으로 표현할 수 있는 것이다. 그렇다면 그리스도인인 우리가 가져야 할 세상과 삶에 대한 이해는 어떠해야 하며, 비전은 어떠해야 할까?기독교 세계관그리스도인의 삶에 대한 이해는 성경을 바탕으로 해야 하고, 그리스도인의 비전은 기독교 세계관을 통해 형성되어야 한다. 위대한 철학자의 말이나 심지어 소설, 영화도 우리의 안목을 바꾸어 줄 수 있다. 하지만 죄로 인해 어두워진 우리의 눈과 마음을 밝힐 수 있는 것은 성경뿐이다. 성경이 바로 영적 소경이었던 니고데모의 눈을 밝힌 안경이었던 것이다. 이 안경은 삼중 렌즈로 되어있다. 이 삼중렌즈는 창조, 타락, 구속이라는 각각의 이름을 가지고 있다. 우리에게 있어서 잘못된 관점을 가져 다 주는 경우는 이것들이 분리되어 받아 들여질 때이다. 그렇다면 창조, 타락, 구속의 진리가 어떻게 연결되어 우리의 세계관을 형성하고 있을까?하나님의 창조 계획창조에 대해서 우리는 얼마나 알고 있는가? 우리는 단순히 창세기의 앞부분을 장식하고 있는 하나의 이야기로만 혹은 진화론의 허구성을 비판하기 위한 도구로만 창조를 인식하지는 않는가 생각해 보아야 할 것이다. 창조는 세상의 완성을 향한 하나님의 계획이고 시작이었다. 그러나 우리는 하나님이 세상을 창조 하신 것을 단순히 세상의 처음에 있었던 일로만 받아 들이고 있다. 하나님의 운행은 피조물을 만드신 것으로 끝난 것 아니라 지금도 여전히, 그리고 앞으로도 만물을 붙드신다. 그리고 창조의 진리는 실천적이고 적용이 가능한 의미들도 담고 있다. 역사, 사회에 대한 인식, 결혼과 이혼에 대해, 성의 의미를 어떻게 받아 들일 것인가에 이르기까지 창조의 진리는 본질적인 답이 되어 준다.사람이 특별한 이유사람이 누구인지, 무엇을 위해 사는 존재인지는 영원한 질문이다. 이런 질문에 대한 답을 창조의 진리에서 발견할 수 있다. 창조는 세상의 기원뿐 아니라 사람의 기원을 말해준다. 하나님이 자신의 형상을 따라 만드시고 생기를 불어 넣은 인간의 창조는 분명 말씀으로 만든 다른 피조물의 창조와는 다른 것이다. 또 하나님은 자신이 창조하신 피조물을 인간에게 다스리도록 맡기셨다. 이를 통해 사람은 하나님의 뜻과 섭리 안에서 역사를 만들고 문화를 이루어 가는 존재임을 알 수 있다. 하나님과의 인격적인 관계를 가질 수 있다는 점도 다른 피조물들과는 다르다. 이것은 하나님의 말씀에 대한 약속을 기반으로 한다. 약속에 대한 순종은 삶이고, 불순종은 죽음이며, 인간은 하나님과의 관계 안에서만 안식을 누릴 수 있는 존재이다. 이것은 하나님의 형상을 따라 지음 받았기에 가능한 것이다. 또한 하나님은 인간에게 자유의 의지를 주셨다. 타고난 본성을 바꿀 수는 없지만 우리는 우리가 가진 의지의 측면을 가지고 본성을 다스리면서 사회와 공동체에 속하여 살고 있다. 하지만 인간은 인격적인 자유의 의지로 하나님과의 약속을 깨뜨리는 선택을 함으로 범죄하고 말았다. 이러한 인간의 죄악이 그리스도인의 세계관에는 어떠한 영향을 주고있는가?악과 고통의 문제세상은 분명 하나님의 선한 뜻에 따라 지어졌다. 하지만 우리가 창조 진리만을 가지고 세상을 바라본다면 낙관적인 시각으로 방관하거나 하나님에 대해 부정하게 될 뿐이다. 세상은 창조로 인해 긍정할 수 있지만, 인간의 범죄를 본다면 타락에 대한 성경적 관점 역시 고려되어야 한다. 죄는 하나님과의 언약에 대한 위반 행위이다. 자율의 의지를 가지고 인간은 악을 택하였다. 죄로 인하여, 악으로 인하여 세상은 타락하기 시작한 것이다. 하나님이 심히 좋았더라라고 말씀하신 세상이 타락으로 물들게 된 것이다. 타락의 결과는 어떠한가?타락의 결과타락은 인간에게만 한정적인 것이 아니라 피조 세계 전체에, 우주 전체에 영향을 미쳤다. 인간의 죄성, 타락으로 인해 인간 사이의 관계가 타락하게 되었고, 사회와 문화, 역사도 그 영향을 받게 되었다. 하지만 우리는 타락 이후의 세상에 대해 전적으로 부정해야만 하는가? 타락은 창조의 왜곡이지, 창조 전체를 부정하는 것은 아니다. 다만 왜곡된 피조 세계는 회복의 날을 기다리고 있는 것이다.세상의 소망죄로 인해 타락한 세상이 기다리고 소망하는 것은 무엇인가? 그것은 하나님의 사랑, 자비하심을 인한 소망이다. 아담의 범죄 후 가죽옷을 지어 입히신 것으로 예표 되는 그리스도의 보내심에 대한 약속, 예수 그리스도, 예수그리스도로 인한 구속이 바로 소망인 것이다.구속된 세상구속은 회복이다. 타락으로 인해 비뚤어진 마음이 예수님을 통해 회복되는 것이 구속이다. 이 구속, 구원은 소극적인 의미로는 십자가의 보혈로 죄값을 갚아 주신것으로 출발하고, 적극적인 의미로는 의롭게 된 새사람으로 지음을 받는 것이다. 우리가 의지적으로 죄를 고백하여 사함을 받는 것과 그리스도의 은혜 안에 새사람으로 거듭나는 것 모두 중요하다. 하지만 구속으로 회복되는 것이 끝은 아니다. 우리를 죄에서 구원하시고 의인으로 불러 주시며 하나님의 사랑을, 하나님의 뜻을 전할 수 있도록 허락하신 능력을 가지고 세상의 온전한 구속을 위해 살아야 할 것이다.하나님 나라의 내림천국은 멀리 저 우주에 있는 신비로운 세상으로 추측하는 경우가 많아 있다. 하지만 성경에서 말하는 천국은 예수님으로 인한 세상의 온전한 구속이다. 역사와 문화, 예술의 전 영역이 하나님의 다스림 아래 있게 되는 것이다. 지금 우리는 예수님이 죽으시고 부활하셔서 승천하신 후로 사단의 머리가 깨어진 극적인 영광의 시대를 맛 보고 있다. 하지만 이것이 완성된 천국은 아니다. 도래할 하나님의 나라의 영광을 위해 우리는 세상에 하나님의 다스림이 임하도록 싸워야 하는 것이다. 우리는 ‘이미’와 ‘아직’이라는 긴장 속에서 승리의 날을 고대하며 살아가야 한다.하나님 나라 백성의 삶승리의 날을 기다리면서 구체적으로 우리는 어떻게 살아야 하는가? 우리는 믿음의 선진들에게서 좋은 답변을 얻을 수 있다. 아브라함, 모세, 세례 요한 등 많은 믿음의 사람들은 믿음으로 보이지 않는 것을 보는 것처럼 믿는 사람들이었다. 그들은 보이지 않지만 보이는 것 보다 더 중요하고 귀한 것이 무엇인지 알았던 것이다. 우리에게도 마찬가지이다. 보이지 않는 것을 부정하고 부인하는 것이 아니라, 영생의 기쁨을 맛보며 완성된 하나님의 나라를 기다리며, 소망하며, 인내하며, 바라보아야 한다.나는 제자양육 훈련을 받고 또 전달하면서 요한복음의 니고데모와 예수님이 대화를 나누는 장면을 몇 번이나 보아 왔었다. 니고데모의 영적 소경인 모습을 보았고 그런 니고데모가 가진 의문에 다시 질문으로 니고데모가 진리를 발견하도록 인도하는 예수님을 보았다. 확실치는 않지만 나는 나중 예수님의 장례를 위해 그가 몰약과 침향 섞은 것을 준비하여 온 모습을 보면서 그가 예수님이 말씀하신 진리, 진리이신 예수님을 만나게 되었을지도 모른다는 생각을 해 보았다. 처음에 니고데모가 엉뚱한 대답들을 예수님 앞에서 늘어놓은 것은 그가 진리를 몰랐기 때문이다. 니고데모처럼 나도 나의 삶에 대한, 세상에 대한 엉뚱한 이해로 인해 엉뚱한 행동을 하거나 엉뚱한 생각을 하는 때가 있다. 나에게도 니고데모가 썼을, 보이지는 않지만 그 어떤 안경보다도 나의 눈을 밝히 열어 줄 안경이 필요한 것이다.이 안경의 다른 이름은 바로 성경이라는 것이다. 성경 안에 담긴 창조, 타락, 구속의 진리에 기반 한 기독교 세계관, 성경적 세계관을 통하면 나 자신에 대한 인식 뿐 아니라 세상에 대한 인식도 새로워 진다는 것이다. 창조에 대해 저자가 말한 것 같이, 창조에 대해서 내가 인식하고 있는 것은 창세기 1장 1절로 시작되는 창조 기사가 있다는 것과 다른 피조물에게와는 달리 우리에게 문화 명령이라 불리는 것을 하셨다는 것 그리고 진화론의 허구를 들어낼 도구라는 점 정도였다. 하지만 다시 본 창조의 진리 안에는 하나님에 대해서, 나에 대해서, 세상에 대해서 너무도 자세히 말해 주고 있었다. 창조의 렌즈만이 아니라 타락에 대한 진리와 구속, 하나님 나라의 도래에 대해 다시금 알아가면서 지금 나는 조금씩 창조와 타락과 구속으로 된 안경에 적응하고 있는듯한 느낌이다.아직은 창조, 타락, 구속의 삼중렌즈로 된 안경이 조금은 어지러움을 주기도 한다. 하지만 이 안경이 세계에 대한 바른 통찰을 가지게 해주며, 삶에 대한 바른 안목을 주고 있다는 점에 또, 실재의 삶과 무관하지 않고 실재의 삶에 적용 가능하며, 실천적이라는 점에서 참 감격스럽다. 하나님 나라의 완전한 도래를 기다리며 ‘이미’와 ‘아직’의 긴장 속에 살고 있지만 기독교 세계관이라는 안경을 끼고 있다면 하나님 나라가 세상의 모든 영역에 확장되도록 하는 나의 부르심을 따라 소망 가운데 기뻐하며 살수 있으리라 생각된다.이 책을 읽고 나서 나에게 가장 의미 있었던 것은 시간에 대한 관점이 바뀐 것이다. 사람들은 흔히 과거나 현재보다는 미래에 대해 더 많은 관심을 가지고 치중한다. 나 역시도 미래에 가지게 될 직업, 미래에 이루게 될 가정, 미래에 이루어질 나 자신의 꿈 등을 늘 그려보곤 했다. ‘니고데모의 안경’을 읽으면서 새롭게 다가온 것 중 한가지는 과거, 현재, 미래에 대한 이해였다. 하나님의 창조, 창조에 반하는 인간의 타락, 타락한 인간을 회복하기 원하신 예수님을 통한 구속을 생각하면서, 또 하나님 나라의 도래를 생각하면서 미래에 대해 보이지는 않지만 보이지 않지만 보는 것처럼 믿었던 믿음의 선진들을 통해 보이지 않는 미래를 볼 수 있기를 바라기만 하고 현실에 충실하지 못한 것을 버려야 한다는 결론을 내리게 되었다.

독후감/창작| 2006.07.29| 3페이지| 2,000원| 조회(1,367)

기독교 세계관, 신국원, 니고데모, 창조 타락 구속, 성경적 관점

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