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[예비] 항생물질에 대한 미생물 생육 억제

- 1 -▲ 실험 제목 : 항생물질에 의한 미생물 생육 억제▲ 실험 목적1) 항생물질의 종류, 작용기작2) 항생물질의 activity 측정방법3) 소독제의 종류와 특징▲ 실험 이론■항생물질에 의한 미생물 생육 억제1. 항생물질의 종류, 작용기작항생물질은 생물, 특히 미생물에 의하여 만들어지는 물질로서 세균이나 그 밖의 미생물의 발육과 생활기능을 저지 또는 억제하는 의약품으로 7가지로 분류한다.1) β-Lactam 항생물질계열-미생물의 세포벽 성분인 peptidoglycan 합성에 관여하는 효소를 억제한다.① 페니실린 계열약물은 일반적으로 그람 양성균에는 강한 항균력을 가지나 그람 음성균에는 항균력이 떨어진다. 또한 산에 불안정하고 내성균주 출현의 문제가 있다.종류 :페니실린G, 플루클로사실린, 암피실린, 아목사 실린② 세팔로스포린계열 약물은 페니실린 내성균주에는 효과가 좋으나 페니실린계열에 비하여 항균력이 떨어지는 단점이 있다. 전체적으로 항균력 및 항균스펙트럼의 향상, 내성균주의 극복이 구조변형의 목표이다. 이외에도 cephamycin 및 carbapenem 계열 등의 약물이 출현하였고 β -lactam의 효소에 의한 불활성화와 관련하여 β-lactamase 억제제가 개발되었다.종류: 세프라딘, 세파만돌, 세프로질, 세포티암, 세파클러2) Aminoglycoside계열-구조변형과 관련하여 주목되는 것은 kanamycin관련 약물이다. 이 약물은 그람음성 간균에 대하여 유효하며 요로감염이나 전신감염에 사용하는데 박테리아의 리보좀에 작용하여 단백질함성을 억제하는 기전으로 작용한다. 내성균주의 발현이 문제로 내성균주에도 효과적인 구조변형이 목표이다.종류: 아미카신, 아스트로마이신, 겐타마이신, 이세파마이신, 가나마이신, 스트렙토마이신, 토브 라마이신3) Tetracycline계열-광범위 항균력을 가지며 그 작용기전은 박테리아의 생존에 필요한 금속이온의 킬레이트 제거 또는 단백질의 생합성을 저해, 항균력 향상을 위하여 동족구조가 합성되었다.종류: 독시사이클린, 테트라사이클린- 2 -~4) macrolide계열-항균스펙트럼이 페니실린계열과 유사하며 페니실린 내성균주에도 효과가 있는 경우도 많다. 화학구조상으로 거대락톤 고리와 케토기, glycosidic linkage로 결합된 아미노당을 가진다. 이계열 약물은 단백질합성을 저해한다. 전구구조형태의 약물이 개발되었다.종류: 클라리스로마이신, 클린다마이신, 에리스로마이신, 록시스로마이신5) Rifamycin-거대고리 화합물로 macrolide계열 약물과는 구분한다. 이 계열 약물은 항결핵제로 사용하며 박테리아의 DNA-지향 DNA polymerase를 억제한다.6) Lincomycin계열-그람양성균에 유효한 항생물질로 단백질합성 억제 작용이 있다. 구조상 황원자를 함유한 항생물질이다.7) chloramphenicol-항생물질로 분리되었으나 현재 합성에 의하여 얻으며 광범위 항균활성을 나타낸다. 이 약물은 미생물의 단백질 합성을 억제한다.2. 항생물질의 activity 측정방법(1) Inhibitory activityMIC(Minimum Inhibitory Concentration) 측정균이 성장하지 않는 항생물질의 최소농도 균에 대한 MIC값이 낮으면 균에 대한 감수성이 높다는 원리-항생물질의 항균력을 측정하는 방법. 특정한 미생물 균주의 성장을 억제하는 항생물질의 최소억제 농도 측정.1) 액체 배지 희석법-배양에 사용하는 액체 배지로 항생물질의 2배 희석계열을 만든 후 여기에 희석한 균액을 넣고 배양시켜 균이 성장하지 않는 항생물질의 최소농도를 성장 최소 억제 농도(MIC)로 한다. 배지에 2가 금속이 많으면 항생물질이 킬레이트 형성.균의 이식량이 너무 많아도 안 된다. 사용 배지는 Mueller Hinton broth사용.2) 고체 배지 희석법-임상 분리 균주 등 다수의 균주를 대상으로 MIC를 측정하고자 할 때 또는 항생물질 내성 돌연 변이주를 얻을 목적으로 다수 균주의 MIC를 측정하고자 할 때 한 평판위에 다수의 균주를 도말하여 MIC를 측정하는 방법. 평판 제조용 배지로 MH agar사용.Disc에 의한 항균제의 감수성, 내성 검사법-6.35mm크기의 disc를 평판 배지에 이식 된 균 위에 놓고 배양 후 생긴 저지원의 크기를 측정하여 항생물질에 대한 감수성 정도 및 내성 결정.(2) Determination of the susceptibility(감수성 시험)1)디스크 확산법 (disk diffusion method)-기초배지로 Muller-Hinton agar 배지가 흔히 사용된다. 한천의 표면에 면봉으로 시험균주의 균액을 고르게 접종하고, 그 위에 항균제 디스크를 놓는다. 배양시간 동안 디스크의 항균제는 주- 3 -위의 한천으로 확산하므로, 디스크 바로 주변의 한천에는 항균제가 고농도로 분포하지만, 디스크에서 먼 곳의 한천에는 항균제가 낮은 농도로 분포한다. 이와 같은 한천의 항균제 농도경사에 의해서 세균 증식의 억제대가 형성된다. 즉, 디스크와 일정 거리에 있는 한천의 항균제 농도는 시험균주에 대한 MIC가 되며, 이 point보다 안쪽의 한천에서는 균주가 증식을 못 하지만, 이 point 밖에서는 균주가 증식한다. 디스크 확산법에서는 이 억제대의 지름을 측정해서 균주의 시험항균제에 대한 감수성 양상을 결정한다.디스크 확산법으로는 MIC를 측정할 수 없다. 또한 증식이 느린 세균, 혐기성 세균 등의 항균제 감수성을 측정할 수 없는 단점이 있다. 그러나 이 방법은 시험이 간단하고, 비용이 적게들며, 시험항균제를 수시로 바꿀 수 있는 장점이 있다. 우리나라의 미생물 검사실 대부분은 이 방법을 이용해서 항균제 감수성 시험을 하고 있다. 최근 일본에서는 디스크 억제대의 크기가 MIC와 비례하는 점을 이용해서 디스크 확산법으로 MIC를 추정하는 방법도 개발되었다.2) E-test 확산법 (E-test strip method)-확산법을 이용한 항균제 감수성 시험 방법이다. 그러나 일반적인 디스크 확산법과는 달리 MIC를 측정할 수 있다. 방법도 쉽고 간편하기 때문에 통상적인 감수성 시험에 사용할 수도 있다. 그러나 Etest strip의 가격이 상당히 비싸며, 항균제당 넓은 면적의 평판배지가 필요한 단점이 있다.3. 소독제의 종류와 특징소독제는 병원미생물을 사멸시키는 약제. 손가락·피부·점막·수술부위의 소독에서부터 식기·기구·기계·실내·배설물·화장실·우물·수영장·수도물 등에 대한 전염병 예방은 물론, 각종 병원균의 오염을 방지하기 위해 사용된다.① 페놀계최초로 널리 사용되기 시작한 방부제이며 소독제로 페놀과 크레솔, 자이레놀, 정페닐페놀 등의 페놀계 화합물은 실험실이나 병원에서 소독제로 쓰인다. 펜놀계 화합물은 단백질을 변성시키고 세포막을 파괴한다. 페놀은 결핵균을 죽이고 유기물질이 있는 경우에도 효과적이며 오랫동안 표면에 활성을 지닌 채로 남아있어 소독제로 아주 좋은 제제 이지만 냄새가 강하고 피부에 자극성이 있다는 단점이 있다.② 알코올계세균과 곰팡이 모두 효과적으로 작용하나 포자를 파괴하지는 못한다.지질을 함유하는 바이러스 가운데에도 알코올에 의해 파괴되는 것이 있다. 가장 널리 쓰이는 알코올 소독제는 에탄올과 프로판올이며 보통 70~80%의 농도로 사용된다.단백질을 변성시키고 막의 지질을 분해하기도 하는 것으로 생각된다.③할로겐계할로겐 요오드와 염소는 중요한 항 미생물제로 요오드는 피부방부제로 사용되며 세포의 구성성분을 산화시키고 단백질을 요오드화시켜 세포를 사멸한다, 고농도로 사용하면 포자를 파괴할 수도 있다. 그러나 피부에 손상을 주고 얼룩을 남기거나 알레르기를 유발할 수 있다. 최근에는- 4 -요오드가 유기물매개체와 복합된 요오드포아로 사용되기도 한다.염소는 도시에서 식수 공급 시에 그리고 수영장 물을 소독하는 일반적인 소독약으로 사용되며 유가공이나 식품가공 산업에서 쓰이고 있다.염소가스 형태로 사용되거나 차아염소산 나트륨 또는 차아염소산 칼슘의 형태로 사용된다.세포물질이 산화되면 세균과 곰팡이의 영양세포는 파괴되나 포자는 파괴되지 못한다.④ 중금속수은, 은, 비소, 아연, 구리등의 중금속이온은 오랫동안 살균제로 사용되어 왔다.최근에는 중금속이 비교적 독성이 적으며 더 효과적인 다른 살균제로 대치되었는데 대부분의 중금속은 세균을 죽이는 것이 아니라 세균의 성장을 억제하는 작용을 한다.중근속이 -SH 작용기를 지닌 단백질과 결합하면 단백질을 비 활성화한다.중금속과 결합한 세포단백질은 쉽게 침전된다.⑤ 4차 암모늄이온 화합물합성세지로 극성친수기와 비극성 소수성기가 모두 있기 때문에 물질을 적셔서 유화시키는 작용을 한다. 양친매성 특징을 지니고 있기 때문에 합성세제 용액은 불용성 잔존물을 녹여서 제거할 수 있게 한다. 음이온성 세제도 어느 정도 미생물의 생장을 막는 특성이 있지만 양이온성 세제가 소독제로 효과적이다. 이런 소독제 가운데서 가장 널리 쓰이는 것은 4차 암모늄이온 화합물로 양 전화를 띤 암모늄 이온과 긴 소수성 탄화수소 사슬을 포함한다. 이 물질은 미생물의 막을 파괴하고 단백질을 변성시킨다.염화 벤잘코니움과 염화 세틸피리디니움과 같은 양이온성 세제는 대부분의 세균을 죽이지만 내생포자는 영향을 주지 않는다. 안정하고 독성이 없으며 자극성이 적다는 장점이 있지만 경수에서나 비누가 있으면 활성을 잃는다. 양이온성 세제는 부엌용품이나 소도구를 소독하거나 피부소독에 사용된다.

공학/기술| 2008.06.11| 5페이지| 1,500원| 조회(768)

미생물, activity, 항생물질, 작용기작, 생육

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[결과] 미생물의 분리와 순수배양

- 1 -▲ 실험 제목 : 미생물의 분리와 순수배양▲ 실험 목적1) 순수배양의 의미를 이해하고 방법을 실습한다.2) 미생물의 분리방법을 이해한다.3) culture transfer 방법을 다양한 배지 상에서 익힌다.4) 미생물 배양용 배지의 종류와 제조방법을 익힌다.▲ 실험 방법1. 각 배지성분을 balance를 이용하여 칭량(저울로 무게를 담)하여 삼가플라스크에 담는다.2. 증류수를 첨가하고, 교반기를 이용하여 녹인다.3. 배지 성분이 완전히 녹으면, pH meter를 사용하여 정해진 pH로 맞춘다.4. agar를 첨가하고 auticlave로 15분간 멸균한다.5. 멸균이 끝나면 48-50℃로 맞추어진 항온수조에 넣고 식힌다.6. 배지의 온도가 48-50℃로 유지되면 clean bench에서 멸균된 petridish에 일정량씩 분주한다.7. 배지가 굳으면 petridish를 뒤집어 사용전 까지 냉장고에 보관한다.○ Nutrient broth의 준비(또는 Tryticase Soy Broth)1. 배지 성분을 앞의 방법 1-3의 과정에 준하여 증류수에 녹이고 pH를 맞춘다.2. Dispenser를 사용하여 시험관에 5ml씩 분주하고 배양용 마개를 씌운다.3. Autoclave로 멸균한다.4. 상온에서 냉각시킨 후 사용전까지 냉장 보관한다.● 전분분해효소를 생산하는 고온균주의 분리 및 순수배양1. 전분분해 효소 생산 미생물을 분리하기 위하여 분리 가능성이 높은 분리원을 선정한다.2. 선정된 시료를 멸균 용기에 조심스럽게 채취한다.3. 시료를 1차 회석수에 현탁한 후, 적당한 범위의 colony가 형성되도록 1-진 희석한 후 0.1%tarch 함유 Nutrient agar plate에 spreading한다.4. Spreadingh한 배지를 55℃ 배양기에서 1-2일간 배양한다.5. Colony 주변에 전분분해에 의한 clear zone이 형성된 균주를 백금니를 사용하여 분리하여 Nutrient broth에 옮겨 배양한다.6. Broth에서 균주가 생육하면 다시 0.1%의 전분이 첨가된 Nutrient agar plate에 streaking 하는 과정을 순수한 colony만 형성될 때까지 반복한다.7. 완전히 순수분리된 균주는 glycerol이 20% 함유된 Nutrient broth에 넣어 -20℃또는 -70℃ 냉동고에 보관한다.- 2 -▲ 실험 결과★ Speading원액 원액 1/10.1/100 1/1000★ Streaking ★ 전분분해효소 요오드 용액으로 관찰- 3 -▲ 고 찰이번 실험은 우리가 직접 토양을 떠와서 그 속에 있는 미생물중 우리가 원하는 것을 순수 분리하여 배양 보는 실험이었다. 생물의 순수분리란 L. 파스테르와 R 고흐에 의해서 확립된 것으로 어떤 세균 원생동물 곰팡이들을 병원체로 확정하기 위해서는 다른 종류가 혼입되지 않은 상태에서 실험할 필요가 있다. 먼저 실험의 순서는 토양을 증류수로 섞은 후 그것을 원액, 1/10, 1/100, 1/1000의 비율로 다시 증류수와 혼합한 후 0.1% starch를 함유한 Nutrient agar plate에 spreading해서 배지를 55℃의 배양기에 배양하는 것이다. 55℃에서 하는 이유는 토양에 있는 미생물중 먼저 전분을 분해하는 효소를 찾는 거지만 그중에서고 열안정성을 가진 미생물을 찾기 위한 것이다. 이러한 미생물을 찾기 위해서는 조교님께서 말씀하신 것처럼 source를 온천근처에서 얻는다면 이러한 미생물을 더욱 찾기가 쉬울 것이다.그렇다면 배양 시 plate를 뒤집어서 배양하는데 그 이유는 무엇일까? 그것은 오염(contamination)을 방지하기 위해서이다. 눈에 보이지 않는 세균이나 fungus등은 공기 중에서 위에서 아래로 쉽게 떨어져 원하지 않게 배지위에서 자라는 경우가 종종 발생한다. 따라서 배지를 뒤집어 배양시키면 바람이 강하게 불지 않는 이상 오염의 확률이 많이 떨어지게 된다. 또한 배지에서 생성되는 습기(물)로 인한 contamination을 막기 위해서이기도 하다. 세포를 배양할 때에는 37도나 기타 다른 온도, 즉 따뜻한 곳에서 배양하게 되는데 이때 배지로부터 수분이 나오기 때문에 그 수분이 세포에 영향을 주지 못하게 하기 위한 것이다.그리고 streaking을 하였다. 이미 조교님께서 균주를 미리 순수배양해 온 것을 다시 petridish에 streaking 하는 것이었다. streaking streaking은 오른쪽 그림처럼 처음에는 매우 촘촘히 해서 셀을 퍼트리고 다음 순 서차례에서 앞에 순서에 했던 셀을 끌어다가 지그재그 모양으로 퍼트린다. 그렇게 해서 3번째에 가서는 넓은 지그재그 형태로 긋게 되면 단일coloy를 관찰할 수 있게 되는 것이다.그리고 1/1000의 spreading한 plate에 요오드를 첨가한 것이 다음 사진인데 이를 통해서 전분분해효소를 가진 미생물을 눈으로 확인 할 수 있다. 전분은 요오드에 의해 보라색으로 염색되는 원리를 이용한 것으로 보라색이 염색되지 않고 텅 빈 것은 미생물이 전분을 영양분으로 소모했다는 사실을 보여주며 그 자리가 효소가 있는 자리인 것이다. 이번 실험은 비교적 쉬운 실험이여서 무사히 끝난 것 같다. 하지만 조원 중 1명이 streaking을 실패했는데 그 원인은 wire loop를 알콜램프에 가열하고 즉시 streaking을 해서 그 열로 인해 미생물이 죽게 된 것이다. 이런 작은 실수가 완전히 다른 결과를 가져올 수 있다는 것을 명심하고 다음 실험에 임해야겠다.

공학/기술| 2008.06.11| 3페이지| 1,000원| 조회(3,061)

미생물, 배지, 순수배양, 미생물의 분리, culture transfer

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[예비]미생물의 분리와 순수배양

- 1 -▲ 실험 제목 : 미생물의 분리와 순수배양▲ 실험 목적1) 순수배양의 의미를 이해하고 방법을 실습한다.2) 미생물의 분리방법을 이해한다.3) culture transfer 방법을 다양한 배지 상에서 익힌다.4) 미생물 배양용 배지의 종류와 다양한 배지상에서 익힌다.▲ 실험 이론1. 배지미생물 연구에서 미생물을 키우고 유지할 수 있는 능력은 적당한 배지가 존재할 때만 가능하다. 배지는 미생물의 생장에 필요한 영양물질이 모두 들어 있어야 하는데 특수한 배지를 이용해 미생물을 분리하고 동정할 수 있으며, 항생제에 대한 감수성을 측정하고 수질 및 식품 검사를 수행한다. 모든 미생물이 에너지, 탄소, 질소, 인, 황, 무기질 공급원을 필요로 하지만 영양 요구성은 미생물마다 아주 다르기 때문에 배지의 조성도 미생물의 종류마다 다르다. 때로 특정한 미생물을 선별하여 배양하거나 특정한 종을 동정하기 위해 배지를 선택하는 경우가 있는데 이런 경우 배지를 어떤 용도로 사용할 것인가에 따라 그 조성이 달라진다.2. 배지의 종류:배지는 물리적 상태, 조성원, 사용목적에 따라 나눌 수 있다.① 물리적 상태-액체배지-고체배지 : 액체배지에 한천, 젤라틴, 실리카겔 등 젤을 형성하는 물질을 첨가하여 제조. 한천(Agar)이 가장 이상적으로 평가되는데, 그것은 대부분의 미생물이 그것을 이용하지 못하기 때문이며, 일반적으로 한천을 1.5~2%정도 넣어서(많이 넣을수록 딱딱한 배지가 만들어짐) 만든다. 고체배지는 목적에 따라 평판배지, 사면배지, 고층배지로 나뉜다.② 조성원-천연배지 : 육즙, 맥아즙, 혈청 등을 주성분으로 한 배지.-합성배지(synthetic medium) : 그 조성을 완전하게 알고 있는 배지로 특정배지라고도 한다. 이런 합성배지를 이용하여 실험할 미생물이 어떤 물질에 대사하는지 알 수 있으므로 미생물연구에 널리 쓰인다.-복합배지(complex medium) : 화학조성을 모르는 성분이 포함된 배지로 영양물질이 충분하게 들어 있는 여러 종류의 미생물이 한 종류의 배지에서 자랄수 있기 때문에 유용하다. 도 한 특정한 미생물의 영양 요구성을 잘 알지 못해서 합성배지를 만들 수 없는 경우에도 유용하게 사용된다.- 2 -③ 사용목적-선택배지 : 특정 미생물의 생장을 도모하고 다른 미생물의 생장을 억제시킴 으로써 원하는 미생물만 선택적으로 배양하는데 사용하는 배지. MacConkey agar 배지, Salmonella-Shigella 배지 등.-분별배지 : 배지에 특정한 지시약 등을 첨가함으로써 세균의 혼합집단에서 특정 미생물을 분리하기 위한 배지로 장내세균 분별에 쓰이는 EMB(Eosin-methlene blue)배지가 예이다.-증식배지 : 여러 미생물이 공존하고 있는 경우 원하는 미생물이 보다 잘 자랄 수 있도록 영양분을 첨가하는 배지 ex) 혈액영양배지.3. streak plate와 pour plate① streak plate여러 미생물이 섞여 있는 혼합물을 백금이나 면봉을 이용해 한천배지의 한쪽 끝에 접종 한 다음 여러 형태를 그리면서 표면 전체로 획선을 긋는다. 이 과정 중에 어떤 지점에 이르면 백금에서 단일세포가 떨어져 나와 한천 표면에 묻게 되고 이것이 자가 분리된 집락을 형성한다.② pour plate세균과 진균류의 순수배양에 널리 쓰인다. 원래의 시료를 여러 번 희석해서 배양접시에 부었을 때 미생물이 각각 분리된 집락을 형성할 수 있도록 한다. 여러 번 희석한 시료 약간을 45℃ 정도 식힌 액상 한천 용액과 섞어 이를 즉시 멸균한 배양접시에 붓는다.한천이 굳은 다음 각각의 세포는 그 자리에 고정되어 개별 집락을 형성한다. 30~300개정도의 집락이 나타난 배양접시 집락을 센다.4. 순수배양이란유전형이 같은 세균을 기른다는 뜻이다. 주위에 있는 세균들은 한 가지가 아닌 여러 종류가 존재한다. 같은 세균종이라 해도 유전형이 조금씩 다를 수도 있다. 이런 것을 실험하기 편하게 하기 위해서 순수배양을 해서 유전형이 같은 세균을 분리해서 실험하는 것이다. 실험 방법에는 도말이라는 간단한 것이 있다. 평판배지에 여러 가지 세균들이 있는 세균 pool을 조금 따서 희석시켜가면서 도말을 한다. 그리고 나서 배양기에 넣어서 기르면 콜로니를 이루는 것이 나타난다. 바로 이것을 따서 다시 기르면 순수배양을 하는 것이다. 유전형 같은 세균이 증식해서 동그랗게 콜로니를 이루는 것이기 때문이다. 만일 여러 가지 세균이 너무 많이 있었다면 동그란 콜로닌 나오지 않고 떡 같은 모양으로 나오게 된다. 그래서 이것으로 배양시켜 실험을 하는 것이다.5. 실험기구 조사1. Autoclave : 고온 ·고압 하에서 합성 ·분해 ·승화·추출등의화학처리를 하는 내열 ·내압성 용기.- 3 -2. BOD incubator : - 내부에 유리문이 있어 내부의 온도를 변화시키지 않고 미생물 관찰용이- 자연대류와 안정성 있는 chamber에 의하여 Cultures의 건조가 없다.- 문을 여닫은 후 짧은 회복시간 (37℃로의 회복시간이 1min)- 내부 chamber는 청소가 용이하도록 Round로 되어 있고, 청결을 유지하기 위해 stainless로 되어있다3. clean bench : Clean bench는 국부적 작업공간을 완전하게 무균,무진 장치로서 용이한 청정 환경을 유지하기 위함이다.▲ 실험 방법1. 각 배지성분을 balance를 이용하여 칭량(저울로 무게를 담)하여 삼가플라스크에 담는다.2. 증류수를 첨가하고, 교반기를 이용하여 녹인다.3. 배지 성분이 완전히 녹으면, pH meter를 사용하여 정해진 pH로 맞춘다.4. agar를 첨가하고 auticlave로 15분간 멸균한다.5. 멸균이 끝나면 48-50℃로 맞추어진 항온수조에 넣고 식힌다.6. 배지의 온도가 48-50℃로 유지되면 clean bench에서 멸균된 petridish에 일정량씩 분주한다.

공학/기술| 2008.06.11| 3페이지| 1,000원| 조회(730)

미생물, 배지, 배양, 순수배양, 미생물의 분리

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[결과] 항생물질에 대한 미생물 생육 억제

- 1 -▲ 실험 제목 : 항생물질에 의한 미생물 생육 억제▲ 실험 목적1) 항생물질의 종류, 작용기작2) 항생물질의 activity 측정방법3) 소독제의 종류와 특징▲ 실험 방법○ Part AKirby-Bauer antibiotic sensitivity procedure(실험방법)1. 준비된 배지에 대수증식기에 있는 미생물 배양액을 적정량 떨어뜨린 뒤 멸균 swab으로 골고루 문질러 Spreading한다. (배양액의 흡수를 위해 잠시 방치하여 물기가 없도록 한다.)2. 멸균된 paper disk에 각각의 Antibiotics 또는 Disinfectant를 적정량 떨어뜨려 흡수시킨다.3. 멸균 핀셋으로 그 Paper disk를 Indicator균주를 overlay한 agar plate위에 올려놓고 살짝 누른다.4. 정해진 온도에서 일정 시간 배양 후 억제환의 생성여부와 억제환의 크기를 측정한다.● Part BDetermination of MIC in liquid culture(실험방법)1. 생육배지에서 항생제를 2진 희석한다.2. 대수증식기의 배양액을 0.1% 접종한다.3. 각 균주의 최적 생장 온도에서 24시간 배양한 뒤 흡광도를 측정하고, 균주의 생육이 완전히 억제된 시험관의 항생제 농도를 통해 MIC를 결정한다.■ 항생물질설파제와 함께 화학요법의 주류를 이루고 있다. 미국의 S.A.왁스먼이 anti(항)+bios(생명)에서 따서 antibiotics, 즉 항생물질이라고 명명하고, 1945년부터 일반화되었다. 그러나 그 존재에 대해서는 이미 알려져 있었고, 연구도 꽤 진행되고 있었다. 즉, 1887년 프랑스의 파스퇴르가 미생물은 상호 견제하며, 곰팡이가 병원체에 대항한다는 것을 관찰한 이래, 세균상호간의 길항현상에 관해서 많은 세균학자가 보고하고 있을 뿐 아니라, 한 미생물이 다른 미생물의 발육을 저지하는 물질을 만들어내는 것을 위시하여 그 실험성과도 유효성분의 추출에서 정제의 단계까지 이르고 있었다. 그러나 모두 다른 영역에서의 연구의 부산물로 얻어진 것그것의 엑스를 만들고, 이것이 그람양성균에 효력이 있는 것을 관찰하여 이 물질을 페니실린이라고 명명하였다. 그러나 이것을 치료에 이용한 것은 10년이 경과한 1938년에 영국의 약리학자인 플로리가 페니실린에 주목하여 재 연구를 시작하게 되면서 1941년에야 그 치료효과를 확인하였다. 이것을 페니실린의 재발견이라 부른다.- 2 -■ 항생물질의 종류항생물질을 작용 메커니즘으로 분류하면, 다음과 같다.① 페니실린계, 세팔로스포린계와 같이 세균의 세포벽의 합성을 저해하여 살균적으로 작용하는 것② 폴리펩티드(콜리스틴 ?폴리믹신)나 폴리엔계의 항진균제와 같이 세포막에 장애를 일으켜 살균적으로 작용하는 것③ 리팜피신이나 항종양성의 항생물질과 같이 핵산의 합성을 저해하는 것④ 마클로라이드나 테트라시클린계와 같이 단백질의 합성을 저해하여 정균적으로 작용하는 것⑤ 아미노 배당체계와 같이 살균적으로 작용하는 배당체계의 것살균성인 것은 감염병소 내의 농도를 일정농도 이상으로 높이고, 또 점균성의 것은 발육저지농도 이상을 장시간 유지시키는 것으로서, 투여법의 연구에 의하여 양자를 나누어 사용하면 치료효과를 향상시킬 수가 있다. 현재로서는 페니실린계, 세팔로스포린계 ?아미노 배당체계의 것이 주류를 이루고 있다.■ 항생물질의 작용기작① 세포벽합성의 저해 → inhibit bacterial cell wall enzymesa. Penicillin-binding Proteins (PBPs) : Transpeptidases and Transcarboxylaseb. Bacitracin,Cephalosphorins, Cycloserine, Penicillins, Vancomycin, carbapenems,② 단백질 합성의 저해 : Ribosome에 작용하여 단백질 합성을 저해a. Chloramphenicol, Erythromycins, Lincomycins, Tetracyclines, Aminoglycosides③ 핵산 합성 저해a. DNA 합성 저해 : DNA topoisomerasesb. RN,Trimetrexate④ 조효소 합성계 또는 대사계에 대한 저해 - 주로 growth factor analogs에 의해a. 엽산 (Folic acid)합성 저해 : Sulfonamides or sulfa drugs (Folic acid 합성의 전구체인 para-aminobenzoic acid(PABA) 와 구조 유사)b. NAD 대사 저해 : INH (nicotinamide의 유사체)⑤ 호기성 호흡 저해작용:a. 전자 전달 chain에 작용 → 호기성 호흡 저해b. 주로 항진균제c. 선택 독성이 약함⑥ Targeting plasma membrane components: 세포질 막에 장애를 일으켜 세포질 내의 각종 이온, 아미노산, 핵산 등을 용출시켜 사멸시킴. 선택 독성이 약하고 부작용을 일으키기 쉬움 → 세포막 구성지질 성분이 표적a. polymyxins: alter permeability by insertion in cell membrane through interaction with phospholipidsb. Polyenes: alter permeability by insertion in cell membrane through interactionswith sterols (Nystatin, Amphotericin B)- 3 -■ 항생물질의 activity 측정방법Inhibitory activity일반적으로 MIC를 측정함MIC(minimal inhibitory concentration): 미생물의 생육을 저해하는데 필요한 최저 농도1. MIC 측정 방법- Test tube를 series로 준비하고 시험균주가 접종된 동일량의 배지를 분주, Inoculum은 103 - 106 cells/ml tube, microwell을 보통 사용하기도 함- 시험하고자하는 항생제의 농도를 조정(일반적으로 1/2 단계적 농도로 함, 즉 stepwise 2-fold dilution으로, 예: 128, 64, 32, 16 mg/ml), positive control(항생제 무)는 적어도 107 cell/ml tube를 나타냄, last" clear tube의 항생제 농도가 MIC이와 같이 MIC는 stepwise 2-fold dilution과 visual determination 방법을 사용함으로 아주 정확한 방법은 아님, 그러나 항생제 연구와 임상에 있어서 아주 유용한 parameter로 사용되고 있음, 시험균주에 따라(예: species), 실험조건에 영향을 받음2. 고체 배지상에서의 측정방법액체 배지 상에서와 기본적으로 동일, 109 cells/ml 정도의 시험균주(피검균)가 함유된 MH(Mueller-Hinton, Difco) 배지를 기본으로 반 합성배지를 주로 사용. 배양 후에 균 생육 여부를 관찰. 한 번(1 plate)에 여러 시료에 대한 MIC 측정이 가능- 농도 : 100 ㎍/ml로부터 2배 희석(100, 50,2 5, 12.5, 6.25, 3.13, 1.56, 0.78, 0.39, 0.20, 0.10, 0.05, 0.025 등). 100 ㎍/ml 이상인 경우에는 200, 400, 800, 1,600 ㎍/ml으로- Inoculum(접종균액) : 약 106 cells/ml, 장기간 보존한 균주를 사용할 때는 적어도 1회 이상 계대 배양하고 계대 배양 직후의 균을 사용. 37℃에서 18-20시간 정도 배양하면 S. aureus 209P와 E. coli NIHJ 균주의 경우 108-109 cells/ml에 달함.- 4 -▲ 실험 결과▲ 고 찰우선 이번 실험은 방선균과 효모, 그리고 대장균이 몇 가지 종류의 항생제에 어떠한 activity를 나타내는 지를 관찰하고 실제로 어떤 성질에 의해서 그 항생제에 견디고 또는 죽는 지를 알아보는 실험이었다. 굉장히 간단한 실험이라서 빨리 끝나기도 했고 결과도 좋을 것이라고 예상했었다. 하지만 결과는 생각보다 좋지 않았다. 방선균과 효모는 잘 자라지 않았는데 처음에 plate에 spreading시 초기 cell양이 작았던 것이 문제였던 것 같다. 원래라면 cell이 진하게 나와서 cloli는 10%락스와 Kanamycin 항생제 작용에 의해서 clear zone이 나타날 것이다. 왜냐하면 Ampicillin에 저항하는 유전자 벡터가 삽입되어있는 mutation된 E.coli이기 때문에 Ampicillin에 대해서는 저항해서 환이 생기지 않을 것이다. 그리고 효모는 10%락스에만 항생작용을 가지는데 효모는 진핵세포이므로 Ampicillin, Kanamycin, Thiostrepton 같은 세균항생제에 아무런 효과를 보이지 않을 것이다. 그리고 방선균은 10%락스와 thiostrepton에 의해 clear zone을 보인다. E.coli는 그람 음성균이고 방선균은 그람 양선균이며 효모는 세균이 아니라 진핵세포이다. 위의 항생제 물질들은 세균이 그람양성균이냐 음성균이냐에 따라 효과가 있고 없는 성질을 가진다. 예를 들어 페니실린은 우리가 이번 실험에 다루지 않았지만 그람 양선균에 효과가 좋으며 Ampicillin과 Kanamycin은 그람음성균인 대장균에 효과가 있다. 하지만 대장균이 Ampicillin의 저항 유전자가 있어서 항생효과가 나타나지 않았다. 반대로 Thiostrepton은 그람 양성균인 방선균에 항생효과를 보인다. 그래서 대장균인 음성균에게는 항생효과가 나타나지 않았던 것이다. Ampicillin은 페니실린계 약물 종류중 하나이다. 모든 페니실린계열의 약물은 기본적으로 세균의 세포벽에 존재하는 펩티도들리칸 층의 합성을 방해하는데, 즉 세균의 세포벽을 일부 망가뜨림으로서 세균의 보호막을 파괴하는 것이다. 그렇게 되면 당연 cell death가 일어나게 된다. 실험결과가 만족스럽게 나오지 못해서 MIC방법으로 항생제의 activity를 알아보지는 못했다. 실제로 환의 크기를 보고 항생제가 그 미생물에 대한 항생효과를 알아볼 수 있지만 효모와 방선균은 원래의 cell양이 많지 않아서 눈에 보이는 만큼의 환의 모양을 측정할 수가 없었다. 이러한 실험 방법을 통해 균이 갖는 항생제 저항성이나 또한 어떠한 균의 생장을 억제 또는 살균하기 위다.

공학/기술| 2008.06.11| 5페이지| 1,000원| 조회(930)

미생물, activity, 항생물질, 소독제, 생육 억제

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비 누 화 반응(Saponification)

1. 비 누 화 (Saponification)유지는 산?알칼리, 과열된 증기, 리파제(lipase) 등에 의하여 분해되는데, 이 중 알칼리에 의한 가수분해를 특히 비누화(saponification, 라틴어 sapo는 ‘비누’라는 뜻)라 한다.2. 비누화 반응1) 에스테르의 염기촉진에 의한 가수분해 반응에스테르는 산 가수분해반응을 할 뿐 아니라 염기촉진에 의한 가수분해도 한다. 이 에스테르의 염기촉진에 의한 가수분해를 대표적으로 비누화 반응이라고 부르기도 한다.에스테르를 수산화나트륨과 환류 시키면, 알코올과 산의 나트륨 염이 생성된다.카르복실산 이온은 음전하를 띠고 있기 때문에 친핵성 치환반응에 대한 반응성이 대단히 작다. 그 결과 에스테르의 염기촉진에 의한 가수분해는 근본적으로 비가역적 반응이다.에스테르의 염기촉진에 의한 가수분해반응 메카니즘은 또한 아실 탄소에 친핵성 첨가-제거 반응이 관여된다.[반응 메카니즘: 염기 촉진에 의한 에스테르의 가수분해]이 메카니즘에 대한 증거는 동위원소로 표지된 에스테르로 연구한 것에서 볼 수 있다. 에스테르의 에테르형 산소가 18O로 표지된 프로판산 에틸을 NaOH수용액으로 가수분해시키면 모든 18O로생성된 에탄올에서 나타난다. 18O는 프로판산 이온에서 전혀 나타나지 않는다.이 표지실험 결과는 위에서 주어진 메카니즘과 완전히 일치한다. 만일 수산화이온이 아실 탄소 대신 알킬 탄소를 공격했다면 알코올은 표지가 되지 않았을 것이다. 알킬 탄소를 공격하는 일은 거의 전혀 관찰되지 않는다.친핵성 공격이 아실 탄소에서 일어난다는 증거는 부제성인 알코올의 에스테르를 염기촉진에 의한 가수분해를 시킨 연구로부터 볼 수 있다. 경로 A(아실 탄소에서의 반응)에 의한 반응은 알코올의 배위가 보존되도록 한다. 경로 B(알킬 탄소에서의 반응)에 의한 반응은 알코올 배위의 반전을 일으킨다. 실제로 배위의 반전은 거의 전혀 관찰되지 않는다. 부제성인 알코올의 카르복실산 에스테르가 가수분해되는 거의 모든 경우에서 배위는 보존된다.경로 A: 아실 탄소에서의 친핵성 첨가-제거 반응경로 B: 알킬 탄소에서의 친핵성 치환반응카르복실산의 에스테르의 알킬 탄소에 친핵성 공격이 좀처럼 일어나지 않는다 하더라도, 술폰산 에스테르에 대해서는 오히려 우선하는 공격 형태이다.2) 트리아실글리세롤의 비누화 반응생명체로부터 온 카르복실산의 대부분은 글리세롤의 에스테르, 즉 트리아실글리세롤로 발견된다.트리아실글리세롤은 식물이나 동물로부터 온 유지와 지방이다. 흔한 물질인 땅콩기름, 올리브기름, 콩기름, 옥수수기름. 목화씨기름. 버터, 돼지기름, 쇠기름 등이 있다. 실온에서 액체인 트리아실글리세롤은 유지(기름)라고 부르며 고체인 것은 보통 지방이라고 부른다.트리아실글리세롤은 세 개의 아실그룹이 모두 같은 단순한 트리아실글리세롤일 수 있다. 그러나 더 흔한 것은 아실그룹이 모두 다른 혼성인 트리아실글리세롤이다.지방이나 유지를 가수분해하면 지방산의 혼합물이 생긴다.트리아실글리세롤을 알칼리로 가수분해(비누화 반응)하면 글리세롤과 긴 사슬의 카르복실산염의 혼합물이 만들어진다.긴 사슬 카르복실산의 염이 비누이다. 그리고 이 비누화 반응으로 대부분의 비누가 제조된다. 지방과 유지를 수산화나트륨 수용액에서 가수분해가 끝날 때까지 가열한다. 혼합물에다 염화나트륨을 가하면 비누가 침전된다(비누를 분리하고 난 다음 수용액상을 증류하면 글리세롤이 분리된다). 불순한 비누는 여러 번 재침전시켜 정제한다. 화장실용 비누를 제조하고 싶으면 향료를 가하면 된다. 물에 뜨는 비누를 만들고 싶으면 용융된 비누에 공기를 불어넣는다.긴 사슬 카르복실산의 나트륨염(비누)은 거의 완전히 물에 섞인다. 그러나 이들은 낱개의 분자로 녹는 것이 아니다. 매우 묽은 용액인 경우를 제외하고는 비누는 미셀(micelle)로 존재한다(그림 1). 비누 미셀은 보통 카르복실산 이온의 음으로 하전된 카르복실산 그룹이 표면에 쌓여 있고(따라서 극성임), 비극성인 탄화수소 사슬이 내부에 있다. 나트륨이온은 수용액상에 용매화 된 개개의 이온으로 분산되어 있다.[그림 1] 비누 미셀의 일부가 극성인분산매와 접촉하는 모습.미셀의 형성으로 비누가 물에 녹는 사실을 설명할 수 있다. 비누에서 비극성인(따라서 소수성인) 알킨 사슬은 비극성인 환경, 즉 미셀의 내부에 남아 있다. 극성인(따라서 친수성인) 카르복실산이온 그룹은 극성인 환경, 즉 수용액상에 노출되어 있다. 미셀의 표면이 음으로 하전이 되어 있으므로 개개의 미셀은 서로 밀어낸다. 그리고 수용액상에서 분산된 채로 남아있다.비누는 먼지 제거기능을 비슷한 방법으로 수행한다. 대부분의 먼지분자(예를 들어 피부에 있는 것)는 유지나 지방의 층으로 둘러싸여 있다. 물분자만으로는 이들 기름 낀 입자들을 분산시킬 수 없는데, 이것은 물이 기름층을 뚫고 들어가서 개개의 입자를 서로로부터 혹은 입자들이 달라붙어 있는 표면으로부터 떼어낼 수 없기 때문이다. 그러나 비누용액은 그들의 탄화수소사슬이 기름층에 녹을 수 있기 때문에(그림 2) 개개의 입자를 떼어놓을 수 있다. 이렇게 되면 개개의 입자는 카르복실산 음이온의 외각층을 만들게 되고, 더욱 더 유리한 극성표면을 가지고서 수용액 속에 존재하게 된다. 개개의 입자는 서로 반발하여 수용액상에 분산된다. 조금 후 이들은 하수구로 향하게 된다.합성세제(그림 3)는 비누보다 장점이 있다. 즉 이들은 Ca2+, Fe2+, Fe3+, 그리고 Mg2+ 등이 포함된 센물에서도 기능을 잘 발휘하는 것이다. 알칸술폰산이나 수소황산 알킬의 칼슘, 철, 마그네슘염은 대부분 물에 녹고, 따라서 합성세제는 용액 속에 남아있다. 이와 대조적으로 비누는 센물 속에서 사용될 때 침전-욕조 둘레에 고리-을 형성한다.[그림 2] 기름으로 덮인 먼지가비누에 의해서 분산되는 모습[그림 3] 전형적인 합성세제3. 비누화 반응의 그 밖의 공업적 용도1) 가공된 제품의 표면 청정법(Surface cleaning)공업적 방법으로 제작된 제품들의 표면처리시 표면의 일부 혹은 전부에 어떤 특별한 성질이 요구되는 경우 표면처리를 수행하게 되는데, 이에 대해 간단히 설명하면 다음과 같다.고체, 반고체 혹은 액체상태의 오염물질을 표면으로부터 제거하는 표면 청정법(Surface cleaning)로써, 이는 반드시 이로운 것은 아니나 일반적으로는 청정화를 요구하고 있으며, 응착이나 galling 현상의 방지를 위해서는 깨끗하지 않은 면이 유리할 수도 있다. 따라서 금속가공용 윤활유, 고체윤활유, 안료, 폴리싱 및 래핑용 연마제, 먼지 등의 오염물질을 제거하기 위해, 화학적 청정법으로써 화학반응으로 유지를 수용성 알칼리 염으로 변화시키는 비누화 공정이 이용되고 있다.2) PVA(Polyvinyl Alcohol)의 제조공정에서의 새로운 방법완전 비누화된 필름은 물에 녹지 않으며 내유성인 점을 이용해서 식물, 유지, 약품 등의 포장에 이용된다. 투습성 및 강도를 이용해 직물, 섬유의 포장에 이용되며 부분 비누화 PVA필름은 수용성을 이용해서 세제, 농약, 염료의 포장에 이용된다.◈ 제 조 공 정종래는 카바이드, 아세틸렌을 원료로 사용해 왔으나 석유화학공업의 발전과 더불어 에틸렌을 원료로 사용하는 제조법으로 전환되었다. PVA의 비누화 공정은 산 비누화법과 알카리 비누화법이 있고 산 비누화법은 회분이 적은 것이 얻어지므로 유리의 중간막 등에 이용되는 폴리비닐부티랄용 PVA의 제조에 쓰인다. 비닐론 원료용은 오로지 알카리 비누화법에 의한다. 비닐알콜 단량체 생산은 불가능한 것으로 알려져 있으며 PVA는 대부분 메탄올을 이용한 폴리비닐아세테이트의 가수분해에 의해 생산된다. 초산메틸은 순환된 메탄올에 의해 가수분해되고 아세트산은 초산비닐 공장으로 순환된다.최근의 발전경향은 중합과 가수분해 모두 용액상에서 일어나는 연속 공정이지만 초산비닐은 고체이기 때문에 혼합기에서 비누화가 이루어진다. 원래 고분자의 점도에 따라 변하는 성질들과 비누화의 등급에 따라 다른 물성을 갖는 수많은 등급의 제품들이 만들어진다. 가장 폭넓게 쓰이는 것들은 비누화가 약 90%인 것들이었다. 수율 손실을 고려할 때 1파운드의 PVA를 만들기 위해 1.85파운드의 초산비닐이 사용된다.

공학/기술| 2008.06.11| 10페이지| 2,000원| 조회(1,756)

비누, 비누화, 합성세제, 비누화반응, Saponification

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