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[분석실험] TLC, GPC (Thin Layer Chromatography, Gel Permeation Chromatography)

1. 실험목적Thin-Layer Chromatography 와 Gel Permeation Chromatography는 다른 크로마토그래피와는 달리 이동상 및 고정상간의 상호작용이 없이 오직 분리하고자 하는 물질의 크기(분자량)에 의해 분리 된다. 이러한 TLC 와 GPC의 특성을 이용하여 시료를 분자량에 따라 분리되는 것을 확인해 보고 각 실험 방법의 원리와 장단점을 확실히 알도록 한다.2. 실험방법(1) Thin-Layer Chromatography① TLC Plate를 적당한 크기로 자른다.② sample를 spotting 할 곳을 연필로 표시 한다. (6곳)③ Oven에서 110℃로 30분간 Plate를 activation 한다.④ Sample를 연필로 표시한곳에 차례로 spotting 한다.⑤ 후드안에서 spotting 한 곳의 하얗게 보이는 것이 사라지게 드라이로 말려준다.⑥ 전개 용매의 증기로 포화된 TLC chamber 안에 plate를 기울여서 넣고 밀폐한다.(이때 spotting 한곳이 용매에 잠기지 않도록 주의한다.)⑦ 40분동안 전개 한 후 plate를 꺼내서 다시 드라이로 말린다.⑧ 황산 용액과 반응시켜 발색이 되게 한다.(2) Gel Permeation Chromatography①Gel의 준비- Buffer A ( 0.1M KCL, 0.01M Tris, pH7 )를 조제한다.- Sephadex G-25를 유리막대로 잘 저으면서 buffer A에 넣는다.- 2시간 동안 정치한다.- Buffer A를 수화된 gel에 2~4배 넣고 유리막대로 저어준다.- 90~95%의 gel이 가라앉은 후 부유물을 aspirator로 제거한다.- 10~15분간 water pump 또는 vacuum pump를 이용하여 공기방울을 제거한다.② 컬럼충전- column에 물을 약간 채운 후(기포 방지) 유리막대를 기울여서 수지를 흘려준다.- 가능하면 한번에 흘려, 남은 것은 수지가 가라앉기 전에 연속적으로 흘려준다.③ 컬럼의 안정화- 먼저 용매를 흘려주고 수지가 쌓인 column에 물을 채운 후 adaptor를 기울여서 기포가 들어가지 않게 넣는다.④ 컬럼 상태의 확인- 실험을 하기 전에 수지의 균일성을 Blue Dextran으로 확인한다.⑤ 시료의 조제 및 용출- 불용성 물질 및 지질이나 리포 단백질 등의 흡착물질을 원심분리나 filtering을 통해서 제거 한다.⑥ Gel 세척- 0.2M NaOH나 Non-ionic detergents를 흘려준다.⑦ 보관- 미생물의 번식을 막기 위해 0.02% sodium azide로 처리한다.3. 실험결과4. Discussion이번 실험은 Thin-Layer Chromatography 와 Gel Permeation Chromatography를 이용해서 시료를 분자량에 의해 분리하는 것이다.TLC는 깨끗한 유리판 위에 흡착제 알맹이의 층을 만들어 용제증기를 포화시킨 공기중에 세우고 한 끝을 용매속에 담가 모세관현상으로 용제를 위쪽으로 이동시키면 판 아래쪽에 부착시켜 놓았던 시료는 흡착제를 정지상, 용제를 이동상으로 해서 혼합성분이 크로마토그래프적으로 전개되어 분리시키는 것을 원리로 하는 분리방법이다.Thin layer chromatography는 GPC에서의 물질이 동일물질인지를 쉽고 빠르게 알 수 있는 분석방법으로 쓰이기도 한다.Thin-Layer Chromatography는 직접 TLC판을 잘라서 실험을 했으나 Gel Permeation Chromatography는 시간이 너무 오래 걸리기 때문에 실험시간이 모자라서 그 장치와 원리를 익히고 Blue Dextran이 용출되는 것을 관찰하는 것으로 실험을 했다. 또한 우리 조(7조)와 실험시간이 맞지 않아 8조와 함께 실험을 하였다. 우선 Thin-Layer Chromatography의 실험은 G1~G7이 전부 섞여 있는 standard sample 과 7가지를 하나씩 분리한 시료 중 5개를 골라서 spotting 했다. 결과에 있는 그림에서 가장 왼쪽부터 오른쪽으로 standard sample, G7, G6, G4, G1, G3 sample 순이다. G1은 glucose 1개 G7은 glucose 7개의 분자량을 갖는다. 그러므로 분자량이 가장 가벼운 G1이 가장 전개가 높게 되고 G3, G4, G6, G7 순 이어야 한다. 그림을 보면 예상과 맞게 G7이 가장 아래에 있고 G6, G4, G3, G1순서대로 위치해 있는 것을 확인 할 수 있다. 그리고 standard sample은 G1~G7 이 모두 존재하므로 7개의 standard spot 이 나타나며 이 것은 아래부터 위로 G7~G1을 나타낸다. 그러므로 이 standard spot 과 5개의 spot의 위치를 비교해서 각 시료에 들어있는 것이 어떤 분자량을 갖고 있는 물질인지 확인 가능하다.그림을 보고 가로 방향으로 그 위치를 비교해보면 G7, G6, G4, G1, G3가 각각 standard spot 의 높이와 정확히 같은 위치에 있는 것을 확인 할 수 있다. 다만 G6 sample에서 G4와 G2 위치에 연하고 작은 spot이 생겼는데 이것은 G6 sample에 G4와 G2 가 약간 섞여있어서 이러한 결과가 나온 것 같다. G6 sample에 G4와 G2가 섞여 있는 이유로는 이전 실험한 조가 sample를 딸 때 G4나 G2를 spotting 하고 팁을 바꾸지 않은 채로 G6 sample를 땄을 가능성을 생각해 볼 수 있다. 나머지 sample에서는 하나의 spot 이외에는 다른 spot은 보이지 않는다. 그리고 그림을 보면 전개된 흔적이 왼쪽으로 기울여져 있는 것을 볼 수 있다. 이것은 TLC chamber안에 plate를 넣을 때 약간 비스듬하게 기울어져 넣어서 이러한 기울기가 생긴 것 같다. 또한 standard spot 에 비해 5가지 sample의 spot의 면적이 훨씬 큰 것을 볼 수 있다. 이것은 standard sample은 7가지의 시료가 전부 섞여 있어서 개개의 시료에 대한 농도가 진하지 않기 때문에 spot이 작은 반면 5개의 sample은 1개의 분자량을 갖는 물질만 존재하므로 상대적으로 standard sample 보다 농도가 짙어서 spot의 면적이 더 크게 나온 것이다. standard sample 과 G1,3,4,6,7 은 모두 1μl 씩 spotting 했다. 그리고 G6를 spotting 할 때 팁이 빠져서 TLC판위에 떨어졌는데 실험결과를 보면 이것은 오차원인으로 작용하지 않은 것 같다. spotting 양이 1μl로 매우 작은 양이어서 spotting 할 때 매우 조심스럽게 했다. 팁이 plate에 닿으면 실리카겔이 긁히게 된다고 조교님께서 말씀해주셔서 sample 방울을 살짝 떨어뜨리는 방법으로 spotting를 했다. 그리고 spotting 위치는 TLC판 아래쪽에서 약간 위쪽으로 잡았는데 이것은 spotting한 자리가 전개용매로 곧 잠기지 않도록 하기 위해서였다. TLC chamber 에 넣을 때도 아랫부분을 잡으면 이물질이 묻기 때문에 양 옆을 잡고 넣었다.Gel Permeation Chromatography 실험은 실험장치의 이름과 원리, 실험 방법 등을 직접 보고 조교님께서 설명해 주셨다. 이 Gel Permeation Chromatography은 실험시간이 너무 길기 때문에 실험을 조금 밖에 할 수 밖에 없었다.Gel Permeation Chromatography의 기기는 아래의 그림과 같은 모양을 하고 있다. 우리는 직접 실험장치를 보고 각 부분의 역할과 명칭을 배웠다. 또한 실험 조건에 맞게 샘플 범위 안에 드는 레진을 선택해야한다는 것을 알게 되었다. 그리고 간단한 몇 가지 실험을 해보았는데 우선 이전 샘플을 증류수로 씻어주는 것을 해보았다. 그리고 Blue Dextran을 loading 해서 Blue Dextran 이전에 나온 물질을 void volume으로 제거 한 뒤 기기에서 나오는 Blue Dextran을 8분 간격으로 tube에 담았다. GPC 는 GFC 와는 다르게 분자량이 큰 물질이 먼저 용출되게 된다. GFC는 분자량이 작은 물질이 먼저 용출 되게 된다. GPC는 선택된 크기의 작은 구멍을 가지고 있는 가교 고분자 로 채워져 있다. 큰 물질은 특정한 구멍을 가진 구슬(bead)의 작은 구멍 안으로 들어가기에 너무 크기 때문에 그냥 관을 통과해 버리기 때문이다. 작은 구멍에 들어가게 되어 관을 통과하는데 어려움이 많기 때문에 속도가 느려지게 된다. 이 원리를 설명한 것이 아래의 오른쪽 그림이다.

농/수산학| 2008.01.10| 5페이지| 2,000원| 조회(1,083)

Chromatography, TLC, GPC, Thin Layer Chroma..

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[전기영동] 단백질 분자량 측정 (SDS-PAGE)

SDS-PAGE 보고서1. 실험 목적이번 실험은 전기영동 방법중 하나인 SDS-PAGE를 이용하여 단백질의 분자량을 알아보는 실험이다. 전기영동이란 단백질이나 핵산 등의 고분자물질은 하전을 띄므로 이를 기초로 하여 이들 분자를 전기장을 띤 매질(겔)에서 이동 분리시켜 이들의 순도나 성질의 분석 및 분리 등에 사용하는 방법이다. 단백질의 전기영동은 일반적으로 아크릴아미드(acrylamide)를 비스아크릴아미드로 결합시킨 중합체인 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 가장 많이 사용한다. 우리가 실험한 SDS-PAGE는 단백질의 고유의 전하량과 상관 없이 분자량에 따라 분리 할 수 있는 방법이다. 이를 통하여 두 가지 단백질이 섞여 있는 미지의 샘플에 어떠한 단백질이 들어 잇는 지 확인한다.2. 실험재료 및 실험방법(1) 실험재료-시약 및 용액 : separating gel, stacking gel, staining solution, destaining solution, isobutyl alcohol, sample buffer, protein molecular standard, protein sample, D.W- 도구 : spacer, Teflon comb, paper, micro pipet, 유리판- 기기 :power supply, hamilton syringe, gel dryer, boiling water bath, shaker, chamber, centrifugal separator, slab gel apparatus10% seperating gel 조성solution A: 3.3 mLsolution C: 2.5 mLD.W(H2O): 4.2 mLTemed: 5 uL10% Ammonium Persulfate: 50 uLstacking gel 조성solution A: 0.67 mLsolution C: 1.0 mLD.W(H2O): 2.3 mLTemed: 5 uL10% Ammonium Persulfate: 30 uL(2) 실험방법① 전기이동 기에 isobutyl alcohol을 따라버린다. 증류수로 씻어서 완전히 제거한다.⑤ Stacking gel 용액을 만들어 Pasteur pipet을 사용하여 separating gel위에 spacer의 한쪽 면을 따라 살며시 흘러 넣는다. Teflon comb을 꽂을 수 있을 정도까지(0.5～1 Cm) 붓는다. 공기 방울이 생기지 않도록 주의한다.⑥ Teflon comb을 천천히 꽂는다(공기 방울이 잡히지 않도록 주의). Gel을 유리판 끝까지 붓는다.⑦ Gel이 완전히 굳을 때까지 놓아둔다.⑧ sample 20μl 와 sample buffer 5μl 를 섞는다.⑨ 원심분리 한 뒤 끓는 물에 5분간 담가 놓는다.⑩ Teflon comb을 조심해서 제거하고 그 wells에 SDS/electrophoresis buffer를 채운다. 그리고 위쪽 chamber를 씌우고 SDS/ electrophoresis buffer를 아래쪽 chamber와 위쪽chamber에 붓는다.⑪ Hamilton syringe를 사용해서 protein molecular standards와 단백질 시료를 wells에 loading한다.⑫ Loading한 후 위쪽 chamber에 SDS/electrophoresis buffer를 500ml 정도까지 더 붓는다.⑬ Power supply에 연결하여 처음에는 tracking dye가 separating gel에 도달할 때까지 전류를 걸어준다.⑭ Tracking dye가 separating gel의 밑바닥까지 도달하면 power supply와 전기이동 기구들을 분리한다.⑮ Spacers와 유리판을 조심스럽게 분리한 후 gel 을 staining solution에 담가 놓는다.? Staining이 끝난 후 destaining solution에 담가 천천히 교반시켜 준다. 탈색될 때까지 2-3번 정도 destaining solution을 갈아준다.? Destaining이 끝난 후 drying solution에 담가 overnight시킨다.? gel 에 gh size marker와 Low size marker 의 한 띠와 평행한 위치에 있는 것으로 보아 bovine serum Albumin (BSA) 으로 분자량이 66,000 인 단백질인 것을 추정할 수 있다. High size marker의 위에서부터 다섯 번째 띠와 평행한 위치이며 Low size marker의 첫 번째 띠와 평행한 위치이기 때문이다.단백실시료에는 하나의 단백질이 있는 것이 아니고 두가지 단백질을 섞어 놓았다고 조교님께서 알려주셨기 때문에 이제 하나의 단백질을 추정해야 한다. 하지만 Bovine Serum Albumin 의 띠 아래에 하나의 띠가 생긴 것이 아니라 세 개의 띠기 보인다. 이 중에 하나가 우리가 추정하려는 단백질의 띠인데 이것은 일단 위에서부터 아래로 세가지중 맨 위의 띠와 맨 아래의 띠로 간추려진다. 가운데의 띠는 평행한 위치에 High size marker와 Low size marker 의 띠가 보이지 않기 때문이다. 이 두가지중에서 조금 색이 더 진한 것은 맨 아래의 띠이므로 마지막 하나의 단백질은 Glyceraldehyde-3-phosphate Dehydrogenase (rabbit muscle) 으로 추정할 수 있다. 이 단백질은 분자량이 36,000 으로 위의 Bovine Serum Albumin 에 비해서 분자량이 작으므로 더 아래쪽에 푸른색 띠가 생성된 것을 확인 할 수 있다. Glyceraldehyde-3- phosphate Dehydrogenase은 High marker의 위에서부터 8번째, Low marker의 3번째 위치에 해당된다.두 번째 단백질은 그야말로 추정을 한것이며 3가지중 다른것이 될 수 도 있다. Bovine Serum Albumin 의 경우는 띠가 확연히 들어나기 때문에 전혀 혼동의 요소가 없지만 그 아래에는 3가지의 띠가 나타나기 때문이다. 이렇게 띠가 불분명하게 나타나는 데에는 여러 가지 요인이 있겠지만 우선 단백질의 양이 적었기 때문이라 생각된다. BSA는 충분한 량이 존재 하지만 두 띠의 smiling현상이나 측면에 끌림 현상이 나타나는 것을 알 수 있다. 이것은 특히 5,6조의 실험결과에서 많이 나타났다. 이러한 현상의 원인은 단백질 로딩양이 많거나 stacking gel부위가 짧은 경우, 전기영동시 온도가 과도하게 올라간 경우이다. 끌림 현상은 핵산등 high charge, high molecular mass를 갖는 물질들에 의해 일어날 수 있다. 잘 정제된 단백질을 사용하고 로딩하는 시료의 양을 줄이는 방법이 최선이다.또한 BSA를 제외한 나머지의 염색정도가 약하게 나왔다. 이것은 단백질의 양이 적은 경우일 수도 있고 staining 용액이 적어 나타날 수도 있다. Gel내의 SDS는 단백질 염색을 방해하므로 staining 용액으로 충분히 희석 시켜주어야 하며 염색을 2차례에 걸쳐 하면 염색강도가 증가한다.# Sample Buffer의 구성① Tris-HCl : pH buffer 역할을 한다.② glycerol :③ SDS :④ 2-mercaptoethanol :⑤ bromophenol blue :# 전기영동의 원리Acrylamide를 가교제 (cross-linker)로 중합한 polyacrylamide gel은 acrylamide와 가교제의 농도 및 비율에 의해 gel내 미세통로의 크기를 조절할 수 있어 다양한 크기의 생체 분자들을 분리할 수 있을 뿐만 아니라 높은 정밀도와 고분해능으로 인해 오래 전부터 단백질, 핵산 등의 분리에 널리 사용돼 왔다.Polyacrylamide gel은 acrylamide 측쇄 기능기가 N,N'-methylene bisacrylamide와 같은 2개의 기능기를 가지는 화합물에 의해 비가역적으로 중합되어 형성된 polymer이다.가교제로는 N,N'-methylene bisacrylamide이 (일반적으로 bisacrylamide라 한다) 많이 사용되고 있으며, 또는 N,N'-bisacrylylcystamine (BAC), N,N'-diallyltartardiamine (DATD), Ethylene d이 3% 정도의 차이가 있는 polypeptide를 분리할 수 있다.Polyacrylamide gel은 %T와 %C로 표현되는데 %T는 acrylamide와 bisacrylamide의 %중량이며 %C는 가교제인 bisacrylamide의 %중량이다. 따라서 %T와 %C가 커지면 그만큼 미세통로의 크기는 작아지게 되어 작은 물질의 분리에 이용할 수 있게 된다.Acrylamide의 중합은 ammonium persulfate (APS) 또는 riboflavin의 첨가에 의해 개시된다. APS를 사용하는 경우에는 촉매제로 N,N,N',N'-tetramethylethylenediamine (TEMED)를 사용하며 TEMED는 persulfate로부터 자유라디칼의 생성을 촉매함으로써 중합을 개시한다. Riboflavin은 광조사 (photoactivation)에 의해 자유라디칼을 생성하여 acrylamide의 중합을 개시한다. Polyacrylamide의 중합이 해리된 자유라디칼에 의해 시작되므로 gel용액 내의 산소는 중합반응을 방해하게 되는데 gel용액을 사전에 degassing 해주는 이유이다.Polyacrylamide gel을 사용하는 단백질 전기영동법은 크게 두 가지로 나눌 수 있는데 하나의 gel만을 사용하는 연속적 시스템(continuous buffer system)과 buffer조성이 다른 두 개의 겔을 사용하는 불연속적 방법이다 (discontinuous buffer system). 연속 시스템은 pH 3-11 사이의 완충용액을 한가지 선택하여 겔과 음전극액 내 전해질 조성 및 농도를 동일하게 만들어 전기영동하는 방법이고 불연속 시스템은 흔히 우리가 알고 있는 stacking gel을 사용하는 경우이다. 또한 단백질 전기영동법은 ionic detergent의 사용유무에 따라 dissociating 또는 non-dissociating 법으로 구분하기도 한다. Dissociating법은 sodium dodecyl sulfate (SDS)와 같은 ionic d다).

자연과학| 2008.01.10| 6페이지| 2,500원| 조회(2,468)

전기영동, 분자량, SDS-PAGE, 단백질 분리, Acrylamide

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[식품분석실험] 카페인 및 벤조산 정량 ( Spectrometer 이용 )

1. 실험목적각성제로 쓰이는 카페인과 식품 보존료로 쓰이는 벤조산을 Spectrometer를 이용하여 정량적분석한다. 사이다와 데미소다의 캔 하나(250ml)에 들어 있는 카페인과 벤조산의 양을 직접 구해보고 실험원리를 안다.2. 실험방법① 사이다와 데미소다를 degassing 해서 탄산을 제거해준다.② 시료를 4배 희석하여 10ml를 만들고(각각 3개씩) vortexing 해준다.③ Spectrometer 를 이용하여 석영 cell에 증류수를 담고 blank 값을 측정한다.④ 희석한 데미소다 시료와 사이다 시료를 230nm에서 측정한다.(각각 3개씩)⑤ 희석한 데미소다 시료와 사이다 시료를 270nm에서 측정한다.(각각 3개씩)⑥ standard curve를 이용하여 데미소다와 사이다의 카페인 및 벤조산 함량을 계산한다.3. 실험결과벤조산Abs(230nm)BLK0.0571데미소다10.6651데미소다20.6792데미소다30.6792사이다10.1611사이다20.1624사이다30.1568카페인Abs(270nm)BLK0.05데미소다10.4041데미소다20.4086데미소다30.4092사이다10.1156사이다20.1163사이다30.11674. Discussion시료230nm(벤조산) Abs데미소다0.6745사이다0.1601시료270nm(카페인) Abs데미소다0.4073사이다0.1162이번 실험은 standard solution을 이용하여 standard curve를 그리는 것은 조교님께서 해주셨고 우리는 사이다와 데미소다의 230nm 와 270nm 에서의 흡광도만 측정하였다. 각각 3번 반복하여 측정하였다. 평균값을 내보면 다음과 같이 나온다.이제 이 평균 흡광도를 이용하여 조교님께서 그려주신 standard curve 에 대입하면 사이다와 데미소다의 벤조산, 카페인 농도를 계산 할 수 있다.데미소다사이다벤조산4.874mg/250ml1.187mg/250ml카페인8.696mg/250ml2.422mg/250ml위의 계산 값은 standard curve에 대입하여 얻은 농도에 4배 희석 했으므로 4를 곱해주고 나온 농도 단위가 mg/L 이므로 250ml 캔 하나에 들어 있는 양을 구하기 위해 다시 4로 나누어 주어야 한다. 그러므로 결국 standard curve를 통해 나오는 농도가 캔 하나에 들어 있는 벤조산과 카페인의 양이라고 생각할 수 있다. 이 수치는 실제로 캔 하나에 들어있는 수치보다 적게 나왔다. 이것은 개봉한지 오래되었기 때문에 벤조산과 카페인이 휘발되어 손실 되었기 때문이다. 벤조산은 방향족으로 더 잘 날아가는 특성이 있다. 벤조산과 카페인 모두 사이다 보다 데미소다에 더 많이 들어 있는 것을 확인 할 수 있다. spectrometer 로는 대략적인 수치를 얻을 수 있지만 HPLC 등 다른 방법을 이용하면 이보다 더 정확한 정량분석이 가능하다.

농/수산학| 2008.01.10| 2페이지| 1,500원| 조회(1,087)

카페인, 벤조산, 정량, spectrometer, 카페인분석

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[분석실험] HPLC 분석 (고성능 액체 크로마토그래피)

HPLC 보고서1. 실험목적고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC ; High Performance Liquid Chromatography)란 혼합된 시료 성분이 이동상과 고정상 사이를 흐르면서 흡착, 분대 등에 의해 각각의 단일 성분으로 분리되게 하는 Chromatography 이다.HPLC는 매우 작은 지름의 효율이 좋은 입자로 채워진 column을 사용하며 적당한 충진재를 채운 고정성의 관속에 높은 압력으로 이동상인 액체를 흘려주어 혼합시료를 단일성분으로 분리하는 원리이다. 이 방법은 정량과 정성분석이 가능하며 펌프를 이용하여 High pressure 로 solvent를 column에 흘려주기 때문에 다른 크로마토그래피보다 빠르다. 그래서 비휘발성 물질과 열에 약한 성분을 분리하는데 유리하다. 또한 retention time이 GPC 등에 비해 훨씬 정확하기 때문에 더 정확한 결과를 얻을 수 있다.우리는 높은 감도를 갖으며 정확한 분석을 할 수 있는 고성능 액체 크로마토그래피 를 사용해서 시료의 카페인을 분리해보고 이를 통하여 HPLC의 원리와 실험방법 그리고 각 기기의 명칭 및 기능을 알 수 있도록 한다.2. 실험재료 및 방법(1) 실험재료① HPLC 기기 :Solvent Reservoir, Filter, Pump,LcNET BOX, Injection Port, Column, Column oven, Detector, computer② caffeine 용액 (100㎍/㎖), 증류수③ methanol(2) 실험방법① 100㎍/㎖ caffeine 용액을 이용하여 5, 7.5, 10㎍/㎖ 의 caffeine 용액을 만든다.② HPLC 기기를 컴퓨터로 세팅한다. (주입량 0.2ml, 시료이름 등)③ methanol로 한번 루프를 씻어준 다음 시료를 load 한다.(0.2ml 이상)④ Auto Zero 누른다음, wait 램프 꺼지면 Injection으로 레버를 돌린다.⑤ 컴퓨터에 표시되는 chromatogram의 모양과 면적을 확인한다.⑥ 주사기를 methanol로 씻어준 뒤 다른 시료도 같은 방법으로 실험한다.⑦ 3개의 시료를 모두 실험한 뒤 농도에 따른 peak 면적을 비교한다.3. 실험 결과농도5 ㎍/㎖7.5 ㎍/㎖10 ㎍/㎖peak 면적 (mV*sec)69018.96192432.375120010.828높이 (mV)1187.0431257.1621255.486폭 (초)288.900313.700313.24. Discussion이번 실험은 HPLC의 원리와 사용 방법을 알아보기 위하여 농도를 알고 있는 카페인용액을 HPLC 기기를 통하여 peak 면적과 높이 폭 등을 측정하였다. 카페인은 270nm에서 흡광도를 가장 크게 나타내는데 이것을 UV detector를 사용하여 측정 할 수 있다.실험결과에서 나온 peak의 면적은 카페인용액의 농도와 비례한다. 이것은 결과의 그래프를 보면 알 수 있다. 5.0 ㎍/㎖, 7.5 ㎍/㎖, 10.0 ㎍/㎖ 의 농도를 갖는 카페인 요액을 실험에 사용했는데 농도에 비례하게 peak 면적이 나온 것을 확인 할 수 있다. R2 값도 0.9978로 triple 9 이 나오진 않았지만 이정도면 거의 직선에 가까운 추세선이라고 할 수 있다. 만약 미지의 시료의 농도를 계산하려면 위의 추세선의 식에 HPLC 결과로 나온 peak 면적을 y값에 넣어주면 된다. 우리는 미지의 시료는 실험하지 않고 위의 3개의 standard 시료만 실험하였다.한편 retention time 은 시료의 농도가 높을수록 길어져야 하는데 7.5 ㎍/㎖, 10.0 ㎍/㎖에서 그 시간이 거의 차이가 나질 않았다. 오히려 7.5 ㎍/㎖ 에서의 retention time 이 더 길었다. 이것은 실험과정에 오차원인이 있었기 때문이다. 이 오차원인으로는 10.0 ㎍/㎖ 시료를 load 시킨 다음 컴퓨터로 세팅을 한 다음 inject 로 레버를 돌려야 하는데 실수로 세팅을 안 하고 있다가 레버가 반쯤 돌아 갔을 때 세팅을 했다. 이것이 10㎍/㎖ 시료에서의 retention time 이 작게 나오는데 원인이 되었을 것이라 생각된다. 또한 우리가 사용한 HPLC column 은 오래되어서 column 끝부분에서 액체가 새어 나오는 것이 관찰되었다. 그 양은 아주 적은 양이었지만 column에서 시료가 새어나오게 되면 detector에서 감도가 작아지기 때문에 문제가 될 수 있다. 그리고 각 시료의 농도가 다르기 때문에 주시기를 바꿔서 사용해야하는데 우리는 아주 정확한 실험결과를 얻는 목적이 아니기 때문에 하나의 주사기를 methanol로 씻어서 계속 사용했다.용매로는 methanol을 사용했다. 이 methanol은 순도가 높은 것이며 액체내의 gas를 filtration을 통해서 degassing 한 것이다. 이러한 용매를 쓰지 않으면 실험이 정확하게 이루어지지 않기 때문이다.▣ HPLC의 역사- 1941년 Martin과 Synge에 의해 발명된 액체-액체 크로마토그래피(LLC) 이후의 고전적 액체 크로마토그래피에서 느린 분리속도, 부정확한 정확도를 해결하기 위해 여러 방법을 시도하였으나 별 효과는 없었다. 이러한 문제점은 1960년대에 정지상(=충진체)의 직경이 10㎛로 작아지고 기기의 자동화 등으로 액체 크로마토그래피는 기존의 방식보다 더 높은 효율을 나타내었다. 그래서 기존의 액체 크로마토그래피와 구분하기 위해 이것을 HPLC (High Performance Liquid Chromatography or High Pressure Liquid Chromatography)로 명명하게 된다.▣ HPLC의 원리- HPLC 기기의 모식도를 간단하게 나타내면 왼쪽 그림과 같다. 주사기를 사용하여 시료를 루프에 주입하게 되면 시료는 이동상(methanol) 와 함께 column으로 이동하게 된다. 이때 펌프를 이용하여 높은 압력으로 이동상인 액체를 column 내부로 흘려주기 때문에 빠르게 용출이 되도록 한다. 시료 중에 포함된 성분은 각각 정지상과 이동상 양쪽에 분포되어 정지상과 이동상 사이의 평형이 이루어진다. 각 성분의 분자는 정지상과 이동상의 사이에서 순서적으로 분배평형을 유지하며 두 상을 옮겨 다니다가 column 끝 부분에 이르면 용출된다.이때 column이 분배평형이 달라 이동상에 많이 분배되는 경우 빨리 용출되고 정지상에 많이 분배되는 경우 늦게 용출됨으로서 이 용출 시간의 차에 의해 분리가 이루어진다. 이 용출되는 것을 시간에 따라서 detector로 검출하여 컴퓨터가 chromatogram을 그려준다.HPLC 기기는 위의 그림과 같이 복잡하게 여러 기기들이 연결되어 있는 모습이다.각 장치의 명칭과 역할은 다음과 같다.1. Reservoir : 용매를 저장할 수 있는 용기2. 용매 펌프 : 일정한 유속과 압력으로 용매를 밀어주는 장치3. 주입기 : 분석하고자하는 시료를 이동상의 흐름에 실어주는 역할4. 컬럼 : 충진재가 채워져 있어 실질적인 분리가 이루어지는 곳5. 배출6. 검출기 : 분리되어진 물질이 검출되어지는 곳7. Data system : Detector의 시그날을 크로마토그램으로 변화시켜줌▣ LC와 비교한 HPLC의 장, 단점1)장점①LC* 기기비용이 저렴하며, 실험방법이 간단하다.(실험실 및 제조용 분리법으로 적당하다.)②HPLC* 분리시간이 분 단위로 짧다. * 정확도, 정밀도가 높다.(± 0.5~1.0%)* 검출감도가 크다.(10-9g정도) * 기기의 자동화가 가능하다.2)단점①LC* 분리시간이 길다. * 분리도가 낮으며, 정확한 정량이 어렵다.②HPLC* 기기 및 운영비가 고가이며, 실험방법에서 오랜 숙련도를 필요로 한다.* 만족할 만한 Detector가 없다.(대신 여러 종류의 Detector를 각각의 목적에 맞게 사용할 수는 있다.)▣ HPLC의 응용- 음식물이나 수질에서의 잔류 농약 검출, - 해양 생물의 색소 분리,- 화합물의 합성에서의 생성물 확인 및 분리, - 아미노산 분석,- Poly Aromatic Hydrocarbon의 분석, - 단백질 정량분석,- 음용수 내의 잔류하는 페놀류 분석, - 뇨 분석,- 약물이나 음료수 내의 성분함량 검증, - 수 ppm 정도의 저 농도 물질 검출 등▣ 용매의 조건1. HPLC 용도에 맞는 용매 및 비저항 값이 18MΩ이상인 water를 사용한다.2. Viscosity가 낮아야 한다.3. 두 용매를 혼합하여 사용하고자 할 때 Miscibility number(혼화성 지수)의 차가 15미 만이어야 한다.4. 이동상은 고정상을 녹여서는 안 된다.5. 분리코자 하는 시료는 반드시 이동상에 녹아야 한다.6. 두 용매를 섞을 땐 V/V으로 섞어준다.7. Bubble은 제거한다.▣ pump의 조건

농/수산학| 2008.01.10| 6페이지| 2,500원| 조회(5,093)

HPLC, detector, 액체크로마토그래피, Sil-C18, UV 검출기

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[분석실험] Gas Chromatography 를 이용한 지방산 분석.

1. 실험목적이번실험은 현재 가장 많이 사용하는 분석기기중의 하나인 Gas-Chromatography 의 원리와 기기의 명칭과 기능 그리고 사용법을 확실히 알고, 시료 “윌”이란 발효유에서 어떠한 지방산이 어느 정도 들어 있는지 실험해 본다.2. 실험재료 및 실험방법(1) 실험재료- GC 기기 및 장치, ether, 시료(윌), standard solution, 실린지(2) 실험방법① 후드안에서 시료 5ml 에 ether 5ml를 넣어준다.② 원심분리기를 이용하여 1500g에서 10분간 원심분리한다.③ 실린지 세척을 위해 ether를 준비한다.④ GC기기를 셋팅하고 실린지를 이용하여 standard solution을 Injection 한다.(기포가 생기지 않도록 조심한다.)⑤ 컴퓨터로 나오는 peak를 확인한다.⑥ 같은 방법으로 시료 solution 을 Injection 한다.⑦ 컴퓨터로 나오는 peak를 standard solution의 peak 와 비교해본다.3. 실험결과4. DiscussionGas Chromatography는 두 가지 이상의 성분으로 된 물질을 단일성분으로 분리시키는 기법이다. 분리하고자 하는 물질의 각 성분은 이동상(기체, 초임계유체 또는 액체) 및 고정상(분리관에 충전 또는 코팅된 물질, 고체 또는 액체)과의 물리/화학적 상호작용의 차이에 의해 고정상과 이동상에 서로 다르게 분배되어 분리가 이루어진다.이번 실험은 이러한 GC 를 이용하여 시료(윌) 5ml에 어떠한 지방산이 들어있는지 정성적인방법으로 확인하는 것이었다. GC 로는 정성분석과 정량분석이 모두 가능하지만 이번 실험에서는 standard solution의 8개 peak면적을 모두 잡기 힘들기 때문에 정성분석만 하였다. 이번 실험은 실험시간이 우리 조와 맞지 않아서 8조와 함께 실험을 하였다. 실험 결과에 standard solution의 그래프를 보면 8개의 지방산이 제대로 peak 가 뚜렷하게 나오지 않은 것을 볼 수 있다. 이러한 결과가 나온 오차원인으로 우선 다른 조가 모두 실험한 뒤에 하였기 때문에 실린지가 많이 오염이 되어 있어서 이러한 결과가 나왔다고 생각할 수 있다.. 실린지를 제대로 ether를 이용하여 씻어주지 않으면 그 안에 다른 오염물질이 남아 있게 되어 제대로 된 결과를 얻을 수 없다. 실린지를 이용해서 GC기기에 Injection 하는 양이 0.5μl 밖에 안되기 때문에 약간의 오염물질이라도 결과에 큰 영향을 미칠 수 있는 것이다. 다른 오차원인으로는 standard solution를 직접 만들어서 사용하지 않고 이전 실험한 조(7조) 가 만들어 놓은 것을 그대로 사용하였기 때문에 약간의 변화가 생겼을 수 도 있다. 일찍 실험을 한 다른조의 standard solution 의 그래프는 8개의 지방산이 8개의 peak를 보여주고 있는 것을 확인 할 수 있었다. 이제 sample의 그래프를 보자. 시료의 결과는 더욱 안좋은 결과가 나왔다. 제대로 된 peak를 확인하기 힘들 정도이다. 그래도 standard 의그래프는 8개의 peak를 확인은 가능한 정도이다. 하지만 sample의 경우 낮은 높이의 peak가 매우 많이 조잡하게 나와서 지방산을 따로 구분하기가 어렵다. 다른 조(1조)의 경우 hexanoic acid 의 peak가 매우 높게 나왔는데 우리조는 그렇게 나오지 않았다. 이것은 우리가 사용한 시료인 윌을 뚜껑을 개봉하고 오래 되어서 그 성분들이 많이 날아갔기 때문이다. 이 때문에 hexanoic acid를 포함한 다른 지방산도 그 peak 가 제대로 나타나지 않았다. 또한 standard 와 마찬가지로 실린지를 제대로 씻어주지 못해서 문제가 된 것 같다. 지방산의 peak 순서는 acetic acid, propionic acid, iso-butyric acid, butyric acid, valeric acid, 2-ethylbutyric acid, hexanoic acid, heptanoic acid 의 순서로 나왔다. 이러한 순서로 나온 것은 우선 분자량에 기초한 것으로 분자량이 작은 지방산이 먼저 peak가 나오게 된다. 그 다음으로는 지방산들의 극성 비극성 성질에 의해서 peak 순서가 결정된다. butyric acid 와 Iso-butyric acid는 분자량이 같지만 peak는 Iso-butyric acid가 먼저 나왔다. 이것은 우리가 사용한 DB-FFAP 컬럼의 고정상이 극성이기 때문에 비극성의 성질을 띠는 물질이 더 빨리 용출되게 된다. butyric acid 가 Iso-butyric acid 보다 더 극성을 나타내기 때문에 반대로 더 늦게 용출된 것이다. 만약 고정상이 비극성 이었다면 butyric acid 와 Iso-butyric acid의 peak 순서는 바뀌었을 것이다.# DB-FFAP 컬럼조사우리가 사용한 DB-FFAP 컬럼은 총길이 30m, 내경 0.25mm, 필름의 두께 0.25um이었다. 이 DB-FFAP 컬럼의 고정상은 Polyethylene glycol로 되어있고, Nitroterephthalic acid를 처리하여 제작된 극성의 캐필러리 컬럼이다. 고정상의 결합상태는 Bonded & cross-linked 되어있다. DB-FFAP 컬럼의 응용범위로는 산, 알콜류, 알데하이드류, 아크릴레이트류, 케톤류, 니트릴 화합물 등이 해당된다. 특히, 휘발성 지방산과 페놀류 분석에 적합하다.# 검출기에 따른 운반기체DetectorCarrier Gas비 고TCDHeH2N2일반적 감도높으나 취급주의H2 분석시 사용FIDN2H2일반적, 감도높음대체로 사용가능NPDHeH2최적최고감도ECDN2최고감도FPDN2일반적# GC에서 사용 가능한 운반 기체들의 조건① 순도가 높아야 하고,② 비활성이어야 하며,③ 기체의 확산을 최소로 줄일 수 있도록 분자량이 커야 하며,④ 값이 싸고 독성이 없어야 하며,⑤ 검출기에 적합한 기체를 선택해야 한다.# 수소염이온화 검출기(FID, Flame Ionization Detector) 의 원리 및 방법- 원리 : 어떻게 이온화되든지 기체의 전기 전도도가 기체 중의 전하를 띤 입자의 농도에 직접 비례한다는 원리를 이용한 것.- 방법 : FID는 수소와 공기 불꽃에서 시료가 탈 때 전하를 띤 이온을 생성하여 이온 전류를 측정. 즉, 대부분의 유기 화합물은 이 불꽃의 온도에서 열분해되어 이온성 중간체가 형성된다.# GC 기기의 구조# Solid Phase Micro Extraction (고상미세섬유추출) 조사1. SPME 란?SPME(Solid Phase Micro Extraction)는 캐나다 워텔루 대학의 Dr. Janusz Pawliszyn 팀에 의해 개발된 유기용매 없이 분석물질을 추출하는 시료전처리의 신기술이다. 흡착제가 코팅된 섬유에 시료를 농축 및 탈착시켜 분석하는 방법으로 물, 공기, 토양 등 다양한 시료에 적용가능하고 SPEdml 막힘과 용매사용을 보완 한 방법이다. SPME기술을 HPLC 분석에도 적용 할 수 있도록 인터페이스 장치가 개발 공급됨에 따라 비휘발성 시료나 열에 약한 화합물의 분석에도 SPME를 사용할 수 있게 되었다.

자연과학| 2008.01.10| 5페이지| 2,000원| 조회(1,689)

지방산, Gas Chromatography, GC, fid, DB-FFAP

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