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Bradford assay 평가C아쉬워요

2007 Modern experimental biochemistryEXPERIMENT REPORT- UV-Vis spectrophotometer and Bradford assay -? 교과목 : 분석 및 기기분석실험? 실험일 : 2008. 04. 04 14:00~ 17:40? 담당교수 : 최정우 교수님? 학과명 : 생명과학과? 학번 : 2006560040? 성명 : 최학순 (5조)? Principle광원에서 빛이 프리즘(monochromator)을 통과한 후 sample로 입사할 때 Detector로 sample을 통과한 후의 빛의 양을 측정하는 것을 Single beam, 빛이 프리즘을 통과한 후 샘플 및 비교대상(Reference or blank, 측정하고자 하는 물질만 없는 대조군)에 입사할 때 샘플 및 비교대상을 통과한 후의 빛의 양을 detector 1과 2로 각각 측정하는 것을 Double beam 이라고 한다. 이번 실험에서는 spectrophotometer를 사용하여 400~700nm의 파장범위에서 샘플을 scan 했을 때 어떠한 결과가 나오는지 확인한다. 실험에 앞서 다음의 Beer-Lambert 법칙을 알아둘 필요가 있다.T(Transmittance) = I/I0%T(Transmittance) = 100TA(Absorbance) = -log(I/I0) = εLC[ε= molar absorption coefficient(M-1Cm-1), L: path length(Cm), C: concentration(M)]이번 실험에서는 Bradford assay method를 사용하는데 이 방법은 단백질에 특이적으로 반응하는 Bradford 시약을 사용하여 실험을 빠르고 쉽게 수행할 수 있다. 다양한 물질에 대해서 보편적으로 사용할 수 있으며, 염색액과 결합한 단백질도 비교적 안정하다는 장점이 있다. 그러나 흡광도에 따라 실험결과가 달라질 수 있다는 단점이 있다. 따라서 흡광도를 0.5 정도에 맞춰주는 것이 가증 정확한 실험결과를 얻을 수 있는 방법이다.? MaterialsReagent : Bradford 시약, dH2O, 1mg/ml BSA, sample solutionApparatus : 집게, 전자저울, 시료종이, Effendorf tube, vortex, cuvette, Pipette(p1000, p100), Spectrophotometer? Procedure1. In effendorf tubes) 0.02ml protein sample + 1ml of the Bradford Reagent 각각의 투 브에 넣는다.2. Bradford 시약을 잘 섞은 후 실온에 방치한다.3. Prepare protein standards of appropriate concentrations.Standard solution은 희석하여 만든다. (1mg/ml BSA = Standard protein)Standard12345dH2O201510501mg/ml BSA05101520단위(μl)4.1ml Bradford reagent를 각각에 튜브에 넣은 후, 잘 석는다. 총 부피는 1.02ml이다.5. Sample을 실온에서 5분정도 incubate 한다.6. Sample을 Cuvet으로 옮긴다.7. #1은 blank으로 595nm에서 Absorbance를 측정한다. #2,3,4 모두 같은 조건에서 세 번 측 정한다.( 60분 이내에 측정한다.)8. Standard curve와 비교하여 Unknown sample의 농도를 구한다.? Results우선 실험 과정에서 유의할 점을 두 가지 생각해 보았다. 우선 Standard solution의 Blank를 측정하는 이유는 결합 전 후의 파장에 따른 Absorbance 값이 변하면서 겹치는 부분이 생기기 때문이다. 다음으로 Sample의 Absorbance를 측정가능 한 시간은 5분 ~ 60분 정도까지 인데 그 사이에는 우리가 CBBG로 염색한 Protein이 안정하기 때문이다.※ Standard curve and curve's equation + Obtain sample's concentration.excel에서 가로 축의 한 칸을 1로 잡아서 기울기가 0.114로 나왔다. 그러나 실제로는 가로축 한 칸은 0.25이므로 실제 기울기는 0.114 × 4 = 0.456 이다.∴ 추세선의 Equation , Y = 0.456 XSample의 농도(Ｘ)는 0.135 = 0.456Ｘ 이므로 Ｘ = 0.296(mg/ml) 이다.blank1234BSAC0.250.500.751.00% T63.1254.7648.9035.61ABS0.1990.2610.3100.448123Mean ValueSampleC% T78.5771.7369.6673.32ABS0.1040.1440.1570.135결과의 해석주어진 결과를 자세히 이해하려면 Bouguer - Lambert의 법칙의 오차를 우선적으로 이해해야 한다. 이에 따르면 Standard의 농도를 변화시킬 때 흡광도의 변화는 추세선과 같이 직선이 되어야 비어의 법칙에 따르는 것이 된다. 위의 그래프를 보면 1,2의 측정은 추세선 보다 위쪽의 값으로 나온 것을 볼 수 있다. 다음으로 3,4의 값은 추세선보다 아래쪽인 값으로 측정된 것을 볼 수 있다. 전자의 것은 (+)편차가 있다고 하고, 후자의 것은 (-)편차가 있다고 한다. 이러한 오차가 일어나는 원인은 크게 기기적 오차와 화학적 오차로 나누어 생각해 볼 수 있다.실험에서 기기적 오차의 원인은 크게 두 가지가 있을 수 있는데 첫째, 비어의 법칙의 비이상적인 가정이라는 것이다. 즉, 비어의 법칙은 시료가 오직 복사선을 흡수만 한다는 것, 시료의 물질들은 서로 반응하지 않는다는 것, 물질에 의한 복사선의 흡수 과정은 전 부피에서 동일하다는 가정이라는 것이다. 하지만 시료는 반사, 산란, 형광을 낸다. 그러므로 필연적으로 존재하는 오차인 것이다. 둘째, 몰 흡광계수는 굴절률의 함수이다. 즉, 몰 흡광계수 ε= ε실제값 * n/(n+2)2 의 관계를 갖는다. 굴절률은 농도에 따라 변화하기 때문에 또한 농도의 변화에 따라 몰 흡광계수는 변화한다. 하지만 Bouguer - Lambert의 법칙은 ε를 고정된 값으로 생각하기 때문에 필연적으로 실험결과에 오차가 생긴다. 기기적 오차에 관련하여 측정값의 오차가 가장 작은 T의 범위는 15~45%이고, A로는 0.2~0.8이다. 좀 더 자세히 말하자면 A가 0.4343, T가 37%일 때 상대오차가 최소가 된다.이에 미루어보아 우리의 예상한 sample의 농도와 실제 농도 값에 오차를 생각해 보려고 한다. Sample의 mean value A = 0.135, %T = 73.32 이다. 즉, 측정값의 오차가 가장 작을 때의 A와 %T의 값과는 큰 차이가 있다. 그러므로 우리의 실험 결과는 (+)편차의 오차 값이 큰 실험이 되었을 것임을 미루어 짐작해 볼 수 있다. 정확한 오차 값은 계산 하지 못하였다.다음으로 화학적 오차의 원인을 생각해 보려고 한다. 그 전에 우선 계통오차(systematic error)에 대해 알아두고 넘어가야한다. 비어의 법칙에서는 ε이 흡수하는 성분의 농도 C에 무관하다고 한다. 즉, ε이 용질과의 상호작용이 없음을 의미하는데 실제로는 상호작용이 있다. 이러한 오차를 계통오차라고 한다. 이번 실험과 관련하여서는 농도가 낮을 때와 농도가 높을 때의 CBBG에 의해 염색된 후의 파장의 이동에 변화가 생길 수 있다는 것과 관련된다. 즉, 염색된 양에 따라 파장의 이동이 다를 수 있다는 의미이다. 이와 같이 발색시약의 농도가 다른 경우 용액을 Bouguer - Lambert의 법칙에 적용할 때는 모든 용액 중의 화합물(Proteion + CBBG)의 성분을 확인해야한다. 실험과정에서 빠뜨린 부분이므로 이 또한 오차의 원인이 된다.추가적인 의문점Bradford assay할 때 CBBG가 특별히 arginine, tryptophan, tyrosine, histidine and phenylalanine residue에 잘 결합한다고 하는데 그 이유가 무엇인지 잘 모르겠다. 이 아미 노산들의 구조를 보면 arginine을 제외한 세 가지 아미노산에는 benzene고리를 가지고 있 는데 이 벤젠고리에 selectivity가 있는 것인지 아니면 다른 이유가 있는지 궁금하다.? Discussion1.What are the substance that can interfere with the Bradford assay?There is a NON-Protein components - detergents ; Triton X-100 and SDSSDS(sodium dodecyl sulfate)Triton X-100Ionic detergent SDS(charged, denatures proteins)Nonionic detergent Triton X-100(alter a protein's tertiary structure)Detergent의 특성hydrophobic transmembrane domains, integral membrane proteins는 물에 녹는 형태로 독립적으로 추출하기가 힘들다. 이 물질들을 membrane으로 부터 떼어내기 위해서는 detergent가 필요한데, 위의 SDS와 Triton X-100이 널리 알려진 것들이다. Detergents의 특성상 amphipathic 하다. 그러므로 이들이 Membrane으로부터 hydrophobic transmembrane domains, integral membrane proteins 을 녹일 수 있는 상태로 만든다. 이처럼 하는 이유는 protein이 물에 녹으면 아미노산 서열, 질량, 구조 등을 이해할 수 있기 때문이다.SDS 특징;1.charged : 그림에 표시해 둔 것처럼 전기적으로 - , + 를 띈다.2. denatures proteins:all proteins contain only primary structure and all proteins have a large negative charge which means they will all migrate towards the positive pole when placed in an electric field.

자연과학| 2008.06.16| 6페이지| 1,000원| 조회(1,220)

생명과학, Bradford assay, 분석 및 기기분석실험

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