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인간게놈프로젝트

Human Genome Project학 번 이 름게놈이란 생물체를 구성하고 기능을 발휘하게 하는 모든 유전정보를 보유한 유전자의 집합체이다 인간 게놈은 약 30억 개의 염기로 구성되어 있다 게놈에서 유전정보는 DNA라는 분자구조로 존재하며 4가지 화학적 암호인 A·G·T·C 등의 염기서열로 표기되어 있다Genome란?생물체의 생명현상에 관여하는 기능을 갖는 모든 단백질은 그들 유전자의 염기서열에 숨겨진 유전암호를 해석하여 만들어 진다 이는 현존하는 지구상의 모든 생물의 공통된 생명현상의 기본이다 그러므로 생명현상을 이해하기 위해서는 우선적으로 Genome의 염기서열을 분석하는 것이 중요하다Human Genome Project의 배경Human Genome Project란?인간의 염색체 내의 모든 염기서열(유전정보)을 밝혀내기 위한 연구계획 1989년 1월 미국국립보건원(National Institutes of Health/NIH)에서 생물학자, 윤리학자, 컴퓨터 전문가, 산업과학자 등 여러 전문가들이 모인 가운데 'Human Genome 자문위원회'가 발족되었고, 이 위원회의 회의 결과 Human Genome Project라는 연구계획이 시작되었다1986년- 미국 에너지부가 세계 처음으로 Human Genome Project 시작 1988년- '이중나선구조'를 밝혀 노벨 생리 의학상을 수상한 제임스 왓슨이 다국적팀의 초대 책임자로 선정됨 1992년- 미국 미시간대학의 분자생물학자인 프란시스 콜린스가 다국적팀의 책임자로 선정 - 왓슨박사와의 마찰 때문에 미 국립보건원을 떠난 벤터박사는 자신의 'genome 연구소'를 설립, 폐렴의 원인이 되는 헤모필루스 인플루엔자(Haemophilus influenzae)라는 박테리아 genome 해독에 착수Human Genome Project의 개요1995년 -다국적팀은 3백50개 실험실에서 공동으로 2005년까지 인간genome project를 완성하겠다는 목표로 본격적인 연구에 착수 1996년 -다국적팀에 참가하고 있던 과학자들이 대서양에 있는 버뮤다섬에 모여 '정리된 유전자 데이터는 24시간 안에 공개한다'는 유전자 정보 사용안에 동의'버뮤다 원칙' 1997년-인간 genome project (6개국의 16개 연구소) 를 총 지휘할 국립 인간 genome 연구소 (N H G R I)를 설립1998년 - 민간 바이오벤처 셀레라를 설립한 벤터박사는 다국적 연구팀과는 전혀 다른 연구방법을 제시 1999년 초 - 미국 정부가 Human Genome Project를 2000년 안에 완료할 수 있다고 발표함 - 이를 위해 1999년 4월 미국, 영국, 일본, 프랑스, 독일, 중국의 20개 연구소 유전학자 40명이 화이트헤드 유전연구소의 소장 에릭 랜더박사를 중심으로 '유전분석가 그룹'을 결성1999년 - 인간의 22번 염색체 염기서열이 해독 2000년 - 21번 염색체 염기서열이 독일과 일본 연구팀의 공동작업으로 완성 2000년 6월 26일 - HGP와 셀레라 제노믹스사가 공동으로 인간 게놈 지도 초안을 발표 2001년 2월 12일 – HGP와 셀레라 제노믹스사가 전체 인간 게놈 지도를 완성했다고 공식 발표함 Human Genome의 염기서열을 약 99% 정도 밝혀냄'게놈프로젝트'는 크게 두 가지 방법으로 이루어져 왔는데,인간의 DNA를 10배로 준비해서 작은 단위의 절편으로 자른 다음, 이 절편들을 순서대로 맞추어 늘어놓고 순서대로 서열을 읽는 방법미 정부 주도의 '게놈프로젝트' 팀인간의 DNA를 무작위로 자른 다음, 무작위로 자른 절편의 서열을 무조건 읽은 후 그림 조각 맞추듯이 서열을 끼워 맞추는 방법셀레라라는 민간 벤처 회사 슈퍼컴퓨터의 등장과 퍼킨엘머라는 회사에서 개발한 자동 DNA서열 분석 기의 등장에 힘입어 그 기한을 4년 가까이 앞당기게 되었다Human Genome Project의 방법Human Genome Project의 긍정적 측면' Human Genome Project 가 끝나게 되면 인간의 유전자를 암호화하고 있는 30억 개의 염기서열로 만들어진 긴 DNA서열에 대하여 알게 되는데, 이들 중 약 5%가량만이 실제 유전자를 이루고 있는 암호들이므로, 전체 DNA서열에서 어느 부분이 유전자를 암호화하고 있는지를 확인해야 할 것이다. 그 다음으로 진행될 일은 DNA서열에 들어있을 약 10만개의 유전자에 대한 기능분석이다. ' Human Genome Project'는 후속 연구의 발판이 될 뿐만 아니라 전체 염기 서열을 바탕으로 한 대량적인 분석이 가능하게 하므로 유전자 기능에 대한 연구를 가속화 시킬 수 있다.암과 유전병의 퇴치 대머리, 비만 조기에 치료 범죄 해결에 도움 - 경찰은 범죄 현장에서 한 방울의 혈흔을 이용하여 범인을 색출해 낼 수 있다 개인에게 맞는 인공 장기 자신에게 맞는 치료약 어떠한 병적 위험이 닥칠 것인지를 미리 알아서 이에 대비할 수도 있음유전자 정보 조작을 통해 사람의 피부 머리카락 등이 변하게 될 수도 있으며 이는 범죄에 악용될 수 있다 인간복제문제 유전자 연구의 특허권 분쟁 - Smith Kline Beecham 사의 지원으로 TIGR(the sinstitute for Genome research) 연구소에서는 인간 전체 유전자의 85%에 해당하는 유전자의 DNA 염기 서열을 밝힌 바 있다. 이들은 이 정보를 특허로 하여 상업적으로 이용하고자 시도하였고, 이는 큰 논란이 된 적이 있다. - 한 제약회사는 유전자와 관련해 450개의 특허권을 따냈다고 한다.Human Genome Project의 부정적 측면DNA칩의 보편화 -DNA에 결함이 많은 사람들은 보험에 들지도 못하고 입사시험에서도 떨어질 가능성이 크다 -맞선 대신 DNA선을 보고 노총각 노처녀가 될지도 모른다유전정보를 이용한 개인 자료의 철저한 보호 정치적, 사회적 악용을 막는 것 정상과 비정상 구분의 모호성 해결 유전자의 무분별한 변형 및 향상 방지 정보가 효용 있는 곳에 제대로 사용되는 가 유전자를 이용한 생물체 혹은 인류의 통제 방지Human Genome Project의 해결 과제Human Genome Project의 2009년 현황The End{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2009.11.18| 20페이지| 2,000원| 조회(1,069)

인간게놈프로젝트, 게놈, 생명과학, 발표자료, PPT

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protein lysis & bradford assay

1. Date2. Team3. Name4. TopicProtein lysis & Bradford assay5. PurposeCancer cell을 lysis하여 protein을 얻는다.Cancer cell protein의 농도를 측정하여 본다.6. Materialslysis ; lysis buffer, Trypsin EDTA, PBS, tube, pipette, scraperbradford ; protein, BSA, tube, pipette, 96well, spectrophotometer, Bradford dye7. Method* Protein lysis1. Lysis stock solution최종농도양Urea(FW 60.06)8M19.2gCHAPS4%1.6gPharmalyte 3-102%800ulDWup to 40ml2. Lysis buffer 만들기최종농도양Lysis stock solution1ml100mM PMSF1mM10ulProtease inhibitor1mM10ulLysis stock solution + (PMSF + Protease inhibitor)3. Protocol① 위의 조성대로 Lysis buffer를 만든다.② Media를 제거하고 PBS로 1번 washing한다.③ Dish에 PBS 1ml을 넣고 scraper로 세포를 긁어낸다.④ Cell suspension을 tube로 옮긴다.⑤ Centrifugation.(13000rpm, 4℃, 10min)⑥ 상층액(PBS)을 제거한다.⑦ Lysis buffer 200ul를 넣고 vortex후 ice에 20min간 incubation.⑧ Centrifugation. (13000rpm, 4℃, 10min)⑨ 상층액만 따서 -70℃에 보관.* Bradford① Bradford dye를 4℃에서 RT로 실험 직전에 온도를 바꾼다(dye파괴 방지)② Spectrophotomerer를 미리 예열해둔다.③ BSA농도 간격을 정하고 사용할 BSA의 농도에 맞게 volume을 정한다.④ 96well에 정량대로 BSA를 담는다. (BSA/Sample→Bradford)blank0.125mg/ml0.250mg/ml0.500mg/ml1.000mg/mlsampleBSA-5ul5ul5ul5ul5ulBradford200ul195ul195ul195ul195ul195ulTotal200ul200ul200ul200ul200ul200ul⑤ well을 차광한 후에 RT incubation 5min(5분후면 Bradford 활성 감소)⑥ O.D.값을 측정한 후에 추세선을 작성한다.⑦ Sample을 reading해 추세선에서 농도를 예측한다.① KCjunior 실행② New protocol③ Protocol name 설정④ Read Method(wave length) 595nm로 설정⑤ Well type 설정 (96well)⑥ Read plate8. Results* Protein lysis- 하얗고 투명한 단백질을 Huh-7에서 추출할 수 있었다.- 약 1000ul의 단백질을 추출할 수 있었다.- 추출한 단백질은 -70℃에서 다음실험을 위해 보관하였다.* Bradford표1)0.0000.1250.2500.5001.000s11st0.2810.3340.3520.4970.6511.194------1.188------1.186------1.201average0.2810.3340.3520.4970.6511.192그래프1)그래프2)Protein 농도 계산y = 0.377x + 0.281y에 1.192 대입1.192 = 0.377x + 0.2810.377x = 1.192 – 0.281x = 2.416446 ………… x≒2.416∴ Protein 농도 값은 2.416이다.9. Discussion평소 단백질의 농도를 Qubit을 이용하여 측정하는데, 보통 Huh-7에서 추출한 단백질의 농도는 5mg/ml 내외였다. 이러한 차이가 나올 수 있는 이유에는 배양한 Huh-7의 개체수의 차이가 있을 수 있을 것이다.Bradford는 추세선을 이용하여 농도를 측정하기에, 정확도가 많이 떨어지는 것 같다. 좀더 정확히 protein의 농도를 측정하기 위해서는 실험의 횟수를 늘려야 할 것이다.Bradford법에 의한 단백질 정량산성용액에서 Coomassie brilliant bule 염료는 단백질과 결합하게되고, 이로 인해 염료의 최대 흡광도(λmax)는 465nm에서 595nm로 이동하게 된다. 따라서 595nm에서의 흡광도는 단백질의 농도와 비례하게 된다.이 방법은 발색반응 2분 이내에 완결되며, 1시간까지 유지된다. Bradford 방법의 감도는 Lowry 방법보다 좋으며, 미량정량법을 사용하면 1~20μg의 단백질량을 측정할 수 있다. Bradford방법은 빠를 뿐만 아니라 비단백질 성분들에 의한 방해도 거의 없다.10. Reference- HYPERLINK "http://ref.daum.net/item/11210490" http://ref.daum.net/item/11210490- HYPERLINK "http://search.daum.net/search?w=tot&q=bradford%20%B9%FD&ni" http://search.daum.net/search?w=tot&q=bradford%20%B9%FD&ni-l_profile=jockeybottom

자연과학| 2008.11.09| 4페이지| 1,000원| 조회(1,113)

Bradford assay, protein lysis, 종양학

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미생물학 실험보고서-세균의 생장곡선 (Growth Curve)

1. 일 시2. 조3. 실험자4. 제 목세균의 생장곡선 (Growth Curve)5. 목 적미생물의 성장과 분열과정을 이해한다.미생물의 성장은 4단계를 거친다. Lag phase, Exponential phase, Stationary phase, Death phase.6. 준비물균주 (E.coli), LB broth, 5ml tube, 생리식염수, micropipette, micropipette tip, spectrophotometer, 큐벳, 스퀴즈 바틀, 알콜램프, shaking incubator, 휴지7. 방 법1) 15시간 이상 배양 한 E.coli를 10-4배 희석하여 준비한다.2) 멸균된 상태의 배지 10ml에 준비된 E.coli 배양액을 1ml 접종하여 키운다.(37℃ shaming incubator에서 약 200rpm)3) 접종후 4시간 동안 0 time을 포함하여 매 30분마다 시료 100ul에 LB broth 100ul를 첨가하여 큐벳에 넣고 흡광도를 측정한다. (희석배율은 OD 값을 보고 정정할 수 있다.)이후 같은 희석배율로 OD 값을 측정한다.4) 흡광도는 600nm에서 측정하고, 0 time에서의 OD (Optical Density) 는 0.08-0.1로 시작하는 것이 적당하다.5) 배양시간에 따른 흡광도의 변화를 그래프용지를 사용하여 그려보고, 이로부터 Exponential phase 에서의 Generation time을 간접적으로 구해본다.(Generation time = 흡광도의 변화가 2배가 될 때까지 걸리는 시간)6) A600 = 1.0 => 8 X 108 cell/ml 이 공식을 가지고, 시간별 대략적인 cell 수를 계산해본다.8. 결 과측정시간측정값5:300.9476:001.2196:301.2317:001.3047:301.4678:001.6508:301.6339:001.7019:301.691* 측정시간 : 5시 30분부터 9시 30분까지 (30분씩)* 600nm OD값 0.947부터 측정을 시작하였다.① Generatio면 다음 식에 의해서 계산할 수 있다.지금 한 개의 균이 증식을 시작했다고 하면 세포 수는 세대가 바뀔 때마다 2배가 되므로, 제 n세대 균수 = 1×2n(n은 세대수)로 되고, 많은 수(a)의 균을 접종하였을 때 총균수(b)는 b = a×2n이 되므로 이것을 바꾸어 쓰면log b = log a + n log 2세대수(n)는세대시간(g)은, (여기서 t는 배양시간)이번 실험에서 측정값이 0.947인 세균이 4시간 후에 1.691로 되었다.세대시간은 g = (0.301 × 4) / (log1.691 – log0.947) = 4.7816937약 4시간 43분② A600 = 1.0 => 8 X 108 cell/ml 이 공식을 가지고, 시간 별 대략적인 cell 수를 계산해본다.측정시간측정값시간 별 대략적인 cell 수 계산5:300.9470.947 X 8 X 108 = 7.58 X 1086:001.2191.219 X 8 X 108 = 9.75 X 1086:301.2311.231 X 8 X 108 = 9.85 X 1087:001.3041.304 X 8 X 108 = 0.432 X 1097:301.4671.467 X 8 X 108 = 1.736 X 1098:001.6501.650 X 8 X 108 = 3.2 X 1098:301.6331.633 X 8 X 108 = 3.06 X 1099:001.7011.701 X 8 X 108 = 3.61 X 1099:301.6911.691 X 8 X 108 = 3.528 X 1099. 고 찰1. 미생물 생장곡선이란 무엇인가?(생장곡선의 lag phase, logarithmic phase, stationary phase, death phase의 의미)미생물의 생장곡선(growth curve)미생물을 배양할 때 배양시간과 생균수의 대수(log) 사이 의 관계를 나타내는 곡선으로 S자를 그리며 유도기(적응기)와 대수기(로그대수기), 정지기,사멸기로 나누어진다.①유도기(lag phase, induction phase): 균을 새로운 배지에 접A양은 현저하게 증가하고 효소단백질 합성이 왕성해진다. DNA양은 변화하지 않으며, 생균수가 사균수보다 많고 전체적으로 영양성분이 많고 증식에 용이한 환경이다.② 증식기(대수기), 로그대수기(logarithmic phase, exponential phase): 세포가 대수적으로 증식하며, 세대시간, 세포의 크기가 일정한 시기이다. 세포질의 합성속도와세포수의 증가는 비례 하고, 증식속도는 배지의 영양, pH, 온도, 산소 분압 등의 환경 인자에 의해서 결정된다. 세포의 생리적 활성 및 물리적, 화학적 처리에 대해서 감수성이 높은 시기이며, 생균수가 사균수보다 많다. 영양성분이 서서히 감소하고 환경이 서서히 열악해진다.③ 안정기(정지기), 정상기(stationary phase, maximum phase): 생균수는 일정하게 유지되고 총균수는 최대가 되는 시기이다. 일부 세포가 사멸하고 다른일부의 세포는 증식하여 사멸수와 증식수가 거의 같다. 영양물질의 고갈, 대사생산물의 축적, 배지 pH의 변화, 산소공급의 부족 등 부적당한 환경이 되어 균수가 증가하지 않으며, 내생포자를 형성하는 세균은 이 시기에 포자를 형성한다. 생균수가 사균수와 같아지는 시기이다.④ 사멸기(death phase, phase of decline): 생균수가 감소하는 시기이다. 영양분 고갈과 미생물의 대사노폐물로 인해 생육에 최고로 열악한 환경이며, 영양분이 없어진 미생물은 영양분을 얻기 위해 자기 몸의 성분을 각종 가수분해 효소를 이용해 분해하여 영양분으로 사용하게 된다. 다른 미생물을 죽이기 위해 독소를 만들며, 자가소화(autolysis)가 어느 정도 진행되면서 세포가 용해되고 사멸하게 된다.2. 흡광도(OD:Optical Density)란?< 흡광광도계 >- 원리 : 일반적으로 빛(백색광)이 물체에 닿으면 그 빛은① 물체의 표면에서 반사② 물체의 표면에서 조금 내부로 들어간 후 반사③ 물체에 흡수④ 물체를 통과하는 빛등으로 나누어지는데 물체에 의하여 흡수되는 빛의 양은 그 농도에 따라 다ltraviolet, 180~320nm)및 가시광선 (visible, 320~800) 영역에서 빛의 흡수를 이용한다.빛이 시료를 통과하게 되면 시료에 의하여 빛이 흡수되기 때문에 빛의 강도는 약해진다. 시료용 액을 통과한 빛의 양(transmittance, T)은 흡광물질이 존재하지 않았을 때의 빛의 강도(I0)에 대한 흡광물질이 존재할 때의 빛의 강도(I), 즉 T=I/I0로 표시되기 때문에 빛의 통과율은 항상 1보다 작 으며 다음과 같이 %로 표시될 수 있다.%T= T×100빛의 통과율은 시료의 농도와 특별한 상관관계를 나타내지 않지만 그 로그함수는 다음과 같이 시료 의 농도와 일정한 상관관계를 나타낸다.- log T=K×C여기서 C는 시료 중의 흡광물질의 농도이고 K는 상수이다. 위의 식에서 -log T 를 흡광도 (absorbance, A) 라고 한다면 흡광도는 시료의 농도와 특별한 상관관계를 지니게 된다. 그러므로 강도를 비교하여 얻어지는 것이다 .A = K×C위의 A = KC의 관계를 Beer's law라고 한다. 하지만 시료의 흡광도는 위에서 설명한 시료중의 흡광 물질의 농도에 의해서만 결정되지 않는 다. 즉 위의 그림에서 보는 바와 같이 cuvette의 직경 또는 폭에 따라서 흡광도는 달라진다. 또한 흡광도는 물질 고유의 특성에 따라서도 달라지는데 이것을 몰 흡수계수(molar absorptivity)라고 하며 ε로 표시한다. 그러므로 Beer's law는 다음과 같이 쓸 수 있다.A = ε ×b×c여기서 A는 흡광도, ε는 물질 고유의 흡광계수, b는 cuvette의 지경 또는 폭, c는 흡광물질의 농도 를 말한다. 시료용액의 흡광도는 대조구(blank test)의 흡광도에 대한 비율이기 때문에 단위가 없으며 시료 중의 흡광물질의 농도와 정의 상관관계를 지닌다. 그러므로 표준용액용액의 농도에 대한 흡광도가얻어지면 미지농도 시료의 농도를 계산할 수 있게 된다.3. OD600값으로 cell의 성장값을 측정하는 이유?가시광선 영역 중 600nm~75세대 시간이 매우 길게 계산되었다. 측정값이0.947에서 4시간 뒤에 1.691로 변하는 것을 보아, 4시간 안에서도 2배로 증가하지 못함을 알 수 있다. 인터넷으로 검색해본 적절 generation time이 약 20분 내지 30분이라 했을 때, 이번 우리조의 실험은 정확한 값과는 거리가 있었다.이론적인 생장곡선은 S자 커브를 이루어야 하는데, 우리조의 생장곡선은 3개의 둔턱이 있는 S자 커브를 이루었다. 이 구간에서는 그래프의 경사가 지지 않으므로, 이로써 우리 조의 실험에서는 중간중간에, cell이 생장하지 않고 잠시 머무는 정지기가 있었다 할 수 있다.5. 실험에서의 문제점 및 소감생장곡선이 더디게 나온 이유는 무엇일까?미생물의 생장 곡선이 더디게 나올 수 있는 이유로, 배지상태의 E.coli를 바로 사용한 실험과정에 주목하였다.미생물의 생장은 영양분이 부족하게 될 때까지 생장한다고 하였을 때, 대부분의 미생물 생장곡선 실험상에서 사멸기를 관찰하기는 힘들것이다. 따라서 정확한 생장곡선을 얻기 위해서는, 세포가 안정화 되는 시기, 또한 어느 정도 생장이 이루어 진 다음에 측정하는 것이 정확한 값을 얻을 수 있을 것이다. 즉, 하루 전날 미리 배양을 함으로써 (O/N preculture) 본격적인 실험 시에, 모든 세포가 동시에 분열하도록 만들어야 할 것이다.또한 photospectrometry에 사용되는 큐벳을 다같이 사용하였는데, 매번 사용시마다 닦아주고 다시 쓰고 또 닦아주는 과정에서의 cell이 유실되거나, 큐벳에 남아있는 배지로 인한 농도의 희석과 같은 오류도 있을 수 있을 것이다. 또한 200ul의 배양액을 딸 시에, pioetting의 오차도 실험 실패의 근거가 될 수 있다.3번의 정지기를 가진 우리조의 실험은 cell의 증식에 필요한 영양상태 부족 및, cell의 condition이 좋지 않거나, 배지 내부의 pH 증가가 이유가 될 수 있다.10. 참고문헌HYPERLINK "http://biopedia.org/index.php/Measurin희

자연과학| 2008.11.09| 5페이지| 1,000원| 조회(4,802)

E.coli, 흡광도, 미생물학, growth curve, 세균의 생장곡선

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분자생물학 report-DNA Electrophoresis

분자생물학 reportDNA Electrophoresis1. Introduction* 실험 목적DNA Purification 한 것을 Agarose Gel 전기 영동을 통해 DNA를 크기 별로 분리하여 확인한다DNA electrophoresis의 두 번째 도전이다.처음 실험 시에 전기영동 상에서 아무런 띠가 띄지 않았기에, DNA 추출시의 실험에서 잘못되었는지, PCR과정 시에 실수가 있었는지, 아니면 전기영동시의 실수가 잘못된 실험 결과를 가져 온 것인지 알 수 없었다.따라서 어떤 이유가 원인이 되어 실험 실패를 가져 온지 몰랐기에, 이를 확인하기 위해서 전기영동 실험을 다시 해 보기로 하였다.* 실험 원리- 전기영동전기영동은 전기장 안에서 하전된 입자가 양극 또는 음극 쪽으로 이동하는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 따라서, 어떤 용액에서의 하전된 알맹이의 이동속도는 분자 자체의 성질에 따라서 결정된다. 그러므로 전기영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질 들과 같은 하전된 물질들을 분리하거나 분석하는 데 매우 효과적인 수단으로 이용된다.: 전기장의 세기가 1 volt/cm 일 때 어떤 입자의 이동속도v : 입자의 이동속도, E : 전기장의 세기. q : 입자의 알짜 전하f : 입자의 마찰 저항계수(입자의 크기와 모양의 함수)D : 입자의 확산 계수, k : Boltzman상수 ,T : 절대온도-->이동속도는 입자의 전하량 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정< DNA 전기 영동의 기본원리>1) 홈이 파인 겔 만들어 DNA를 홈에 넣고 전류가 겔 사이를 흐르게함2) DNA는 인산기로 인해 음전하를 띠므로 겔의 끝 쪽에 있는 양극을향해 이동3) 마찰력으로 서로 다른 DNA를 분리→ 작은 DNA조각은 용매와 각각의 크기에 맞게 분리(가장 큰 것은 위에 가장 작은 것은 아래)4) 형광염료로 염색하여 자외선 하에서 봄 마찰력을 받아 천천히 움직임.DNA를 분리,정제하여 확인하는 방법으로는 아가로스 겔을 이용하는 전기영동법이 보편적으로 사용된다. 이 방법은 간단하고 소요되는 시간이 짧을 뿐 아니라 밀도, 기울기, 원심분리법으로는 분리할 수 없는 DNA조각들의 혼합물을 분리할 수 있다. 그뿐만 아니라 겔 상에서 DNA는 브롬화에티듐(ethidium bromide)과 같은 형광성 시약으로 처리하면 염색되므로 자외선 하에서 DNA를 직접 관찰할 수 있다.아가로오스 겔을 통한 DNA의 이동속도는 DNA 분자의 크기, 아가로오스의 농도, DNA의 형태, 전류의 세기, 염기 조성 및 온도 등에 좌우된다. DNA는 A,T,G,C가 있고 이들 분자량의 차이에 따라 전기영동이 이루어진다. 게다가 보통 생물의 DNA에는 염기서열의 반복(SSR)이 많은데 이것이 겔 상에서 이동 할때도 이동속도에 차이가 생기게 된다.시판되는 agarose는 완전히 순수 분리된 것은 아니며 다른 다당류나, 염, 단백질 등이 혼합되어 있으며, 이런 물질들이 포함된 정도에 따라 전기영동시 DNA가 이동되는 정도나 DNA가 gel에서 분리되는 정도가 달라진다. 따라서 효소 억제제와 nuclease가 함유되어 있지 않으며 ethidium bromide로 염색할 경우 형광의 배경을 극소로 하기 위한 특별히 정제된 agarose를 구입하여 사용한다.Gel의 기능을 유지하면서 낮은 온도에서도 녹을 수 있게 화학적으로 변형된 low melting agarose는 gel에서 쉽게 DNA를 용리할 수 있도록 고안된 것인데 현재는 잘 사용되지 않는다. 또 일부 시약회사에서는 아주 작은 DNA 조각(10∼500 bp)을 분석할 때 이용할 수 있는, 낮은 온도에서 gel을 형성하는 agarose를 시판하고 있는데 이와 같은 agarose는 일반적으로 사용되는 agarose보다는 DNA가 잘 분리되지만 polyacrylamide를를 높게 하여 사용하므로(4∼10%) DNA 조각들을 gel에서 용출한 후에 제한효소를 처리하면 효소작용이 억제되는 수가 많다.2. Materials and Method① 기구: 전기영동장치, 삼각플라스크, 마이크로 피펫, gel cast(플라스틱,유리) , 폴라로이드 카메라 ,Imaging System(CCD카메라)② 시약: 전기영동 완충용액(Running Buffer)-(TAE; Tris-acetate-EDTA), LE agarose, ethidium bromide, ethanol, Loading buffer(6x), Size marker (DNA ladder)Sample DNA(PCR product, 제한처리 한 plasmid 등)-Ethidium bromide(EtBr)• DNA 염기 사이로 끼어드는 평면구조를 가진 그룹을 지님.Ethidium bromide 원액은 증류수에 10 mg/ml로 녹아 있는 용액으로, 이 용액의 보관은 빛이 차단된 용기에 담아서 실온에 보관한다. 이 원액을 0.5 μg/μl로 희석해 두고 이를 gel에 혼합한다. Ethidium bromide는 강력한 발암물질이고 독성을 지니므로 이 염색액을 다룰 때에는 반드시 비닐장갑을 사용한다. 사용 후에 이 용액은 정화한 후 버려야 한다.• 전기영동하는 동안 ethidium bromide는 음극 쪽으로(DNA와 반대 방향으로) 이동해 가므로 오랫동안 전기영동을 하면 ethidium bromide는 gel에서 모두 빠지게 되어 작은 DNA 조각을 감지하기가 어렵게 된다. 이렇게 되는 경우에는 gel을 ethidium bromide가 0.5 μg/ml 포함된 증류수나 1x TAE 용액에 30∼45분간 담가 염색하였다가 관찰하면 된다.• 파장 254 nm에서의 자외선 : DNA에 흡수되어 색소에 전달파장이 302 nm,366 nm에서는 색소 자체에 자외선이 흡수되어 590 nm의 주황색 형광 가시광선 방출.• Ethidium bromide는 단일가닥과 이중가닥 DNA및 RNA 검색에 모두 사 bromide는 음극 쪽으로 이동해 가므로 오랫동안 하면 gel에서 모두 빠지게 되어 작은 DNA 조각을 감지하기가 어렵게 된다.- 전기영동 buffer• TAE( Tris acetate EDTA)DNA 분자량이 큰 경우 agarose electrophorsis에서 쓰임. (>12kb)너무 반복해서 사용할 경우 DNA band가 smear해 질 가능성.•TBE (Tris borate EDTA)DNA 분자량이 작은 경우, DNA sequencing에 쓰임. (LE Agarose 0.4g + 1xTAE 40ml(1xTAE 용액은 보통 50xTAE 용액을 제조하여 희석Tris 242g + glacial acetic acid 57.1ml + 0.5M EDTA(pH8.0) 100ml 녹여 증류수로 1L 채움)- 전자레인지에 데워서 녹인다.(1분 정도 ; 끓게 되면 농도가 달라지므로 주의한다.)매우 뜨거우므로 반드시 장갑을 착용해야 한다.- Agarose gel을 식힘(60도)- Gel 이 어느 정도 식었을 때, EtBr을 넣어준다.- Gel cast에 gel을 붓고 comb를 꽂음. comb은 시료를 넣을 공간을 마련한다.comb은 주형의 밑바닥으로부터 0.5~1.0mm 정도 위치에 둔다.gel의 두께는 3~5mm 정도로 한다. 두께가 너무 얇으면 찢어져서 sample이새게 된다. comb를 꽂았을 때 기포가 생기지 않도록 주의 한다.- Agarose가 굳을 때까지 기다린다. (약 15분)Gel electrophoresis- gel이 굳으면 comb을 제거하고 electrophoresis tank에 gel판을 옮긴다.- 전기영동 tank에 running buffer(1x TAE)를 gel을 1mm정도 두께로 덮도록 채운다.전기영동 tank와 gel은 동일한 전기영동 완충액을 사용해야 한다. 이온강도또는 pH에 약간의 차이만 있어도 DNA 조각의 이동속도에 크게 영향을주기 때문이다.- DNA sample 을 loading buffer 와 섞어 준다.(sample DNAample 을 넣는다.- 100V 전원을 연결 .붉은 색이 양극 검은 색이 음극이다. 거꾸로 꼽지 않도록 유의 한다.전기장의 방향에 주의하여 전기영동 장치에서 젤의 먼 쪽이 양극이 되게 한다.- 전기영동전기영동을 시작하면 전기분해에 의하여 양극과 음극에서 기포가 발생하고 시약에섞인 염료가 홈으로부터 이동해가는 것이 보인다.loading 염색약(bromophenol bluedye,파란색)이 gel에서 빠지지 않도록 주의한다. 겔이 중간 쯤 가는 정도가적당하다. 감전에 주의한다.- UV transilluminator로 확인한다.- DNA와 결합한 EtBr은 형광을 강하게 나타내기 때문에 band가보이는 것이다.-사진을 찍어 결과를 분석한다.(폴라로이드 카메라 또는 Imaging System(CCD카메라))3. ResultsDNA electrophoresis의 두 번째 도전이었다.왼쪽에 보이는 사진이 두 번째 전기 영동의 결과 사진이다.이번 두 번째 도전에서는 ladder의 띠가 잘 떴으며, sample은 띠가 없이 쭈욱 영동된 모습이다.얼핏 보면 아무것도 전기영동 된 것 같아 보이지 않지만, 빨간 동그라미 부분을 보면, DNA가 전개 되었음을 알 수 있다.하지만 band는 띄지 않았다.4. Discussion첫 번째 전기영동 실험과는 달리 이번 두 번째 전기영동 실험에서는 DNA가 영동 되었으나, ladder와 비교 할 수 있는 band는 띄지 않았다.DNA는 영동 되었으며, ladder의 band도 제대로 떴으나, band가 띄지 않은 이번 실험을 통해, DNA는 제대로 추출 되었으나, PCR이 제대로 안 되었음을 알 수 있다.따라서 원하는 실험 결과를 얻기 위해서는, 추출한 DNA를 가지고 PCR 과정을 다시 수행해야 될 것이다.5. Reference- HYPERLINK "http://enc.daum.net/dic100/contents.do?query1=b19j0368a" http://enc.daum.net/dic100/contents.do?query1=b19언스

자연과학| 2008.11.09| 8페이지| 1,000원| 조회(487)

분자생물학, 전기 영동, DNA electrophoresis

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cancer cell culture

1. Date2. Team3. Name4. TopicCancer cell culture5. PurposeCancer cell의 freezing과 thawing법을 배운다.다양한 Cancer cell의 morphology 및 특성을 이해한다.6. MaterialsFreezing ; Trypsin EDTA, PBS, freezing medium, cryobial tube, 알콜램프,pipette.Thawing ; Medium, culture dish, 50ml tube,7. Method※ Freezing1 실험 전에 medium, Trypsin EDTA, PBS를 37℃water bath에 넣어둔다.2 Cryobial에 연필을 이용해서 naming 한다.3 배양한 cell의 medium을 제거하고 PBS 5ml로 2회 washing 해준다.4 PBS를 제거하고 Trypsin EDTA 1ml 처리하여 cell을 떼어낸다.5 Suspension된 cell을 50ml tube에 옮긴후 centrifugation.(1400rpm, 5min,RT)6 Pellet만 남기고 상층액을 제거한다.7 Freezing medium 1ml을 넣고 pellet을 잘 풀어준다.8 Cryovial에 cell suspension을 넣고 동결.※ Thawing1 동결된 cell을 37℃ water bath에 신속히 녹인다.2 cell을 50ml tube에 medium 9ml과 넣어준 후 centrifugation.(1400rpm, 5min, RT)3 Pellet만 남기고 상층액 제거한다.4 Medium 3ml 넣고 pellet을 풀어준다.5 Culture dish에 seeding 한다.8. ResultsCell thawing 및 freezing5명의 조원이 2개의 culture dish에 Huh-7을 thawing하였으며, 미리 키워진 2개의 Huh-7 dish를 가지고 동결하여 보존하는 freezing을 시행하였다.- Thawing한 2개의 culture dish에는 cell이 골고루 잘 퍼졌다.- 동결 보존하는 cryobial tube는 70℃에 보관하였다가, 다음날 -120℃로 옮겨 보관하였다.Cancer cell 관찰HCT-15약간은 각이 있으며, 날카롭게 생긴 cell morphology를 확인할 수 있었다.(colon cancer cell)Huh-7colon cancer cell과는 달리 둥근 모양을 띄며, cell들이 전체적으로 꽉 차있는 모습을 볼 수 있었다.(liver cancer cell)LOVOHCT-15처럼 각이 진 뾰족뾰족한 모양이나, 각각 cell들의 morphology가 마치 신경세포처럼 긴 팔이 뻗어 있는 모습을 연상시켰다.(colon cancer cell)9. Discussion1. normal cell과 cancer cell의 특성 및 차이점세포주기 조절의 상실암세포는 분열을 중지할 시기를 알지 못하는 미성숙 세포이다. 정상조직의 세포는 인간의 생존이라는 목표를 위해 여러 가지 조절인자의 영향을 받아 그 분열증식이 조절되고 있는데 비해 암세포의 성장은 인간의 생존과는 상관없이 정상적인 조절인자에 의해 조절되지 않는다. 암세포는 정상세포들에 비해 성장인자들에 의한 의존도가 낮고, 계속 분열 증식할 뿐 아니라 죽지 않는 점이 또한 특징이다.유전성암은 하나의 세포로부터 유래 되었다. 유사분열 과정에서 정상적인 조절과정의 기작을 벗어난 세포가 계속 분열을 하게되고, 여기서 발생되는 딸세포 역시 모세포의 특성을 따라 암세포가 된다. 즉 최초에 하나의 세포가 유전적인 변화에 의해 암세포로 변화하고 이 하나의 암세포가 증식하여 암조직을 만든다는 뜻이다.이식가능성암세포는 이식이 가능하다. 암세포를 건강한 동물에 주사하면 세포가 분열하면서 질병이 확산되고 새로운 암세포가 만들어 진다.유전적 변이암세포는 정상세포와 비교해 유전적으로 많은 차이를 나타낸다. 암세포만이 갖는 유전자 변이특성에 선택적으로 염색되는 경우, 암세포는 주위의 건강한 조직과는 다르게 보인다.미분화정상적인 세포는 생겨난 후 그 조직에 합당한 기능을 담당하기 위해 적당한 분화과정을 거치는데 비해, 암세포에서는 이러한 정상적인 조화된 분화가 이루어지지 않는다. 정상세포에 비해 큰 핵 뚜렷한 크로마틴 및 핵소체, 유사분열의 증가 , 이상 분열에 의해 생겨난 거대세포의 출현 등이 분화가 덜 된 암세포가 나타내는 특징이다. 전암단계(아직 암이 되기 전의 단계)에서는 역형성의 기준에는 미치지 못하는 변화가 관찰될 수 있는데 이를 이형성(dysplasia)이라고 한다.밀도의존성 저해작용의 상실배양용기내에서 암세포와 정상세포의 활동을 관찰하면 정상세포는 단층을 형성하고는 활동을 멈추지만 암세포는 다른 세포 위에 쌓여서 자란다는 것을 볼 수 있다. 즉 암세포는 밀도 의존성 저해작용이 없다는 뜻이고 생물체내에서 이런 세포의 중첩으로 종양이 형성된다.국소혈관의 형성 능력정상 세포는 특수한 환경이 아니면 모세혈관을 형성하지 않지만, 암세포는 쉬지 않고 거미줄 같은 모세혈관을 만든다. 이렇게 형성된 모세혈관은 암세포의 보급로가 되며, 모세혈관이 형성되면 암세포는 쉬지 않고 자라서 종양 덩어리로 커진다. 또한 암세포는 산소를 싫어하기 때문에 산소 공급을 차단하기 위해 모세혈관을 울혈상태로 만든다.수소 이온이 많이 붙은 적혈구가 굳어지며, 이런 상태가 오래 지속되면 울혈 현상이라 하며, 이는 모세혈관을 막게 된다.침투성암세포는 조직 경계부위에 정착하며 화학물질을 분비한 다음 정상적인 조직을 뚫고 관통하여 들어간다.확산능력(전이)정상적인 세포는 그 세포가 생성된 특정 장기에서만 살수 있는데 비해 암세포는 처음 발생한 장기로부터 다른 장기로 이동이 가능하며 이동한 장기에서 분열 증식 할 수 있다.기타 특징정상 세포가 암세포로 바뀌면 세포막의 단백질 성분도 바뀐다.우선 정상세포에 있는 파이브로넥틴이라는 단백질 성분이 없어지게 된다. 또한 세포막의 지방 구성도 바뀌어 정상 세포는 콜레스트롤이 보호하고 있지만 암세포는 불포화 지방산으로 싸여 있다.저산소 세포이다.암세포는 무산소 당분해로 나오는 아주 미량의 에너지를 이용하여 자란다. 정상 세포는 산소가 있어야 생명을 유지할 수 있지만 암세포는 산소가 없어도 생명을 유지할 수 있다.아주 강한 산성이다.암세포는 무산소 과정에서 포도당을 락트산까지 분해시키기 때문에 락트산이 쌓여가며, PH가 5.5까지 내려간다. 그러나 정상 세포는 이런 산성에 견디지 못한다. 인간의 체액은 약 알카리성을 유지하는데 PH 7.4정도를 유지하는데 만약 체액이 6.8이하의 산성으로 기울거나 7.8이상의 알카리쪽으로 기울면 생명을 유지할 수 없는 상태가 된다. 체액을 약 알카리성으로 유지하는 장기가 신장인데, 암세포에 의해 산성 물질이 많아지면 신장은 금방 파괴된다.열에 약하다.암세포는 열에 약하여 43.5℃정도가 되면 죽는다. 종양 주위에는 무수히 많은 모세혈관이 형성되어 있지만 울혈 현상으로 인해 영양분이 제대로 공급되지 않기 때문이다.2. Materials의 역할DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Medium)1950년대 Harry Eagle가 개발한 BME라는 세포성장에 필요한 필수 영양분 및 무기염류와 비타민류에 대한 연구의 결과로 얻어진 배지의 변형된 형태이다.가장 널리 사용되는 배지 중 하나이며, BME에 비해서 아미노산이 4배정도 많고, ferric nitrate가 더 첨가되어 있다.다양한 포유동물 세포주 배양에 일반적으로 사용.Trypsin EDTA배양 용기벽에 부착하여 증식하는 세포를 계대하기 위해서는 세포와 세포 간, 세포와 배양용기벽과의 접착을 떨어뜨려, 단일 세포로 된 현탄액(cell suspension)으로 만든 후, 이것을 희석하여 배양. 단백질에 의한 접착을trypsin으로, 칼슘을 통한 결합을 EDTA로 파괴하여, single cell로 분리한다.PBSNaCl을 넣어 등장용액으로 만든 인산완충용액으로, Dulbecco’s phosphate buffered saline(PBS)를 넣어 만든, 2가 이온이 들어가 있지 않은 것이다. 세포끼리의 접착이나 세포와 기질과의 접착에는 칼슘을 매개로 이용하는 것들이 있으므로, 세포 현탄액을 만들때에는 PBS(-)로 wash하여 준다.Freezing medium동결배지. 일반적으로 배양배지, 우태혈청(혹은 우혈청), 동결보호제를 포함.조성은 대게 세포배양배지에 동결보호제(DMSO) 10%(v/v), 우태혈청 20-25%(v/v)를 첨가하여 사용.10. ReferenceHYPERLINK "http://www.path.cam.ac.uk/~pawefish/ColonCellLineDescriptions/HCT15.html"http://www.path.cam.ac.uk/~pawefish/ColonCellLineDescriptions/HCT15.htmlhttp://www.genehunters.co.kr/Training/07_1.htm

자연과학| 2008.11.09| 5페이지| 1,000원| 조회(815)

종양학, cancer cell culture, HCT-15, Huh-7, LOV..

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