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[A+레포트] RNA 분리 및 농도측정과 전기영동법

영양 생화학 실험실험일:학번:이름:제출일:실험조:1. 주제RNA 분리 & RNA 농도 측정 및 전기영동2.재료및기구기구RNA 분리centrifuge, e.p tube, pipette, vortex.농도 측정UV-Vis Spectrophotometer, Cuvette, pipette, e.p tube전기영동Mini gel running kit, UV illuminator, vortex, TAE(tris-acetate) bufferMicrowave oven, pipette, elderlyflask(삼각플라스크), electrophoresis tank, comb, cuvette시약RNA 분리RNA sample(hepatic cell), chloroform, ice, isopropanol, DEPC, PBS, Trizol, 70% ethanol농도 측정RNA sample, DEPC전기영동RNA sample, 1X TAE,6X loading dye, DDW, EtBr, 1kb RNA ladder(size marker).3.실험 목적및원리목적mouse의 hepatic cell로부터 RNA를 분리하고, 분광광도계를 이용하여 RNA의 농도와 순도를 분석한다. 또 agarose gel 상에서 electrophoresis 하여 목적하는 RNA의 농도와 크기를 분석할 수 있다.원리RNA 분리배지에서 배양시킨 hepatic cell을 Trizol을 이용해 plate로부터 분리한 후, RNase 저해제 등을 처리하여 몇 번의 원심분리 단계를 거쳐 RNA를 추출한다. Trizol은 RNA 분해효소 억제제인 guanidinium isothiocyanate가 포함되어 있어 세포를 파괴시키고, 기계적으로 균질화시키는 역할을 한다.흡광계를 이용한 농도, 순도 측정.핵산이 함유된 용액에 의해 흡수되는 자외선의 양은 용액 속에 있는 핵산의 양과 비례한다. 보통 260nm 파장에서 측정하며, 이 파장(A260)에서 1.0은 ml당 RNA 40ug에 해당한다. RNA 용액에 의해 흡수되는 자외선의 000rpm에서 15분간 원심 분리한다.Pellet을 건드리지 않고 상층액을 버린다.DEPC(diethyl pyrocarbonate)로 희석된 70% ethanol 1ml를 넣고 7500rpm에서 7분간 원심 분리한다. -washing(증류수에는 RNase가 존재 할 수 있으므로 DEPC를 사용함)70%의 Ethanol을 버리고 1번 더 2분 정도 Centrifuge를 하여 남은 Ethanol을 제거한다.DEPC 20ul을 넣어 -70°C에서 보관한다.RNA 농도 측정 (UV-vis spectrophotometer 이용)Cuvette에 DEPC 50ul를 넣어 흡광도를 측정한다. ( volume 50ul) - BlankCuvette에 분리 된 RNA sample 5ul과 DEPC 45ul를 넣고 흡광도를 측정한다. ( total volume 50ul) – sample (10배 희석)RNA electrophoresis삼각플라스크에 agarose 0.3g과 1X TAE 용액 30ml를 넣고 microwave oven을 이용하여 알갱이가 없도록 완전히 용해시킨다.(랩을 씌우고 구멍을 뚫은 채로 녹인다)용액을 50-60℃ 정도로 충분히 식힌 후 comb를 꽂은 gel plate에 부어준다.(거품이 생겼다면 plate의 아래로 모아 제거한다)Gel이 굳도록 20-30분간 기다린 후 gel이 굳으면 comb를 조심스럽게 뽑는다.Gel을 전기영동 tank에 (-)charge에서 (+)charge로 loading 할 수 있도록 넣고 1X TAE buffer를 채워준다.*50X TAE (Tris-acetate-EDTA) buffer 조성- tris base 242g- acetate acid 57.1ml- 0.5M EDTA 100ml- DW to 1mlGel kit에 gel을 넣고 gel이 잠길 정도로 TAE buffer를 넣는다.Loading할 sample을 제조한다. (total volume 18ul)조성: 6X RNA loading dye 3ul + RNA sample 5 광도계][사진. 흡광도 측정 결과]RNA electrophoresis[사진. Agarose gel 제조][사진. Agarose gel 제조] [사진. Gel running kit][사진. Sample loading][사진. 전기영동][사진. UV illuminator][사진. 전기영동 결과물 – film][사진. Gene Ruler - 1kb RNA ladder]5. 이 론RNA (Ribonucleic acid)RNA 란?리보핵산(Ribonucleic acid) 또는 RNA는 오탄당의 일종인 리보스를 기반으로 뉴클레오티드를 이루는 핵산의 한 종류이다. 하나의 나선이 길게 꼬여 있는 구조를 지니며 DNA의 일부가 전사되어 만들어진다. RNA는 단백질을 합성하는 과정에 작용하며 일부 바이러스는 DNA 대신 RNA를 유전물질로 갖기도 한다. 핵염기로 DNA와 달리 티민 대신 우라실을 갖는다.RNA는 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%98%A4%ED%83%84%EB%8B%B9" o "오탄당" 오탄당인 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%A6%AC%EB%B3%B4%EC%8A%A4" o "리보스" 리보스를 기반으로 사슬구조를 이룬다. 오른쪽 그림에서와 같이 리보스에 있는 다섯개의 탄소에 번호를 붙였을 때 1번 탄소가 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%95%B5%EC%97%BC%EA%B8%B0" o "핵염기" 핵염기와 연결되며(이 그림의 경우 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EA%B5%AC%EC%95%84%EB%8B%8C" o "구아닌" 구아닌) 3번과 5번은 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%9D%B8%EC%82%B0" o "인산" 인산에 연결된다. 1번 탄소에 연결되는 핵 염기는 [그림. RNA 구조]구아닌 이외에도 Hyperlink "http에서 단백질을 합성하게 된다. 이를 세부분으로 나누면, (Poly) cap, Polyadenyl, translation sequence(실제 번역되는 부분) 으로 나뉜다. Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/TRNA" o "TRNA" tRNA(운반 RNA transfer RNA): mRNA의 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%BD%94%EB%8F%88" o "코돈" 코돈에 대응하는 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%95%88%ED%8B%B0%EC%BD%94%EB%8F%88" o "안티코돈" 안티코돈을 가지고 있으며, 꼬리쪽에는 해당하는 안티코돈에 맞추어 tRNA와 특정한 아미노산을 연결해 주는 효소에 의해 안티코돈에 대응하는 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%95%84%EB%AF%B8%EB%85%B8%EC%82%B0" o "아미노산" 아미노산을 달고 있다.단백질 형성과정[그림. 단백질의 형성 과정] Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EC%84%B8%ED%8F%AC" o "세포" 세포에서 이루어지는 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%8B%A8%EB%B0%B1%EC%A7%88" o "단백질" 단백질의 형성에는 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/DNA" o "DNA" DNA, RNA와 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%EB%A6%AC%EB%B3%B4%EC%86%9C" o "리보솜" 리보솜, Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/%ED%9A%A8%EC%86%8C" o "효소" 효소등이 관여한다.DNA에서 Hyperlink "http://ko.wikipedia.org/wiki/MRNA" o "른쪽 그림의 두 번째 단계)mRNA의 염기서열이 끝날 때까지 위 과정이 반복되면 긴 아미노산 사슬이 형성된다. 이것이 단백질이다. 단백질은 효소에 의해 접혀 적절한 모양을 갖추게 된다.(오른쪽 그림의 끝 단계)세포 내에는 수많은 리보솜이 있어 하나의 mRNA를 이용하여 동시에 작업할 수 있다.RNA의 분석.RNA 분석의 필요성RNA 분리의 주요 목적은 유전자 발현 기작을 분석하는 것이다. 유전자 조절의 원리를 밝히기 위해서 RNA의 구조, 양, 크기 등을 상세히 분석하는 것이 필요하다. 이것은 우선 RNA의 성공적인 분리를 통해 Agarose gel 상에서의 전기영동과 분광계를 이용해 흡광도를 측정함으로써 농도와 순도, 크기를 분석 할 수 있다.(RNA의 질은 RNA 겔을 걸어보았을 때 보이는 23S, 16S, 5S rRNA의 양의 비로 판단할 수 있다.)RNA의 분리포유세포는 보통 한 세포당 약 10-5ug RNA를 포함하고 있으며 이중 80~85%가 rRNA, 15~20%가 tRNA 및 snRNA, 1~5%가 mRNA로 이루어져 있다. rRNA나 tRNA 등은 일정한 크기와 염기서열을 가지고 있기 때문에 전기영동, 초 원심분리 및 크로마토 그래피에 의해 순수하게 분리 할 수 있는 반면 mRNA는 크기도 다양하고 많은 종류가 혼합되어 있기 때문에 한 종류의 mRNA를 순수 분리하기가 쉽지 않다. 그러나 진핵 세포 mRNA는 3’ 말단에 poly(A)를 가지고 있기 때문에 리보솜 RNA나 tRNA등으로부터 분리해 낼 수 있다.RNA를 추출할 때 가장 주의해야 할 점은 핵산가수분해효소에 의해 분해되지 않고 완전하게 얻어지는 것이며 또한 단백질이 제거된 순수한 RNA를 보호하기 위해서는 RNA 추출 시에 사용되는 모든 기구와 시약에 ribonuclease의 오염이 없어야 한다.heparin이나 RNAin은 ribonuclease의 강력한 저해제로써 분해되지 않는 RNA를 얻는 데 매우 유용하다. RNA 분리 시 용액에 첨가되는 SDS(sodium dodecyl sue

자연과학| 2015.05.20| 16페이지| 2,500원| 조회(1,095)

RNA, 전기영동, DNA RNA, 전기영동법, RNA 분리, RNA 농도 측정, RNA 전기영동

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[A+레포트] DNA 농도 측정 및 플라스미드 (plasmid), 전기영동법 (gel electrophorosis)

영양 생화학 실험실험일:학번:이름:제출일:실험조:1. 주제Plasmid DNA 분리 & DNA 농도 측정 & DNA gel electrophorosis2.재료및기구기구Plasmid DNA 분리centrifuge, e.p tube, column(max 750ul), conical tube, pipette, vortex, collecting tubeDNA 농도 측정UV-Vis Spectrophotometer, Cuvette, pipette, e.p tube, TE 완충용액DNA electrophoresisMini gel running kit, UV illuminator, vortex, TAE(tris-acetate) bufferMicrowave oven, pipette, vortex, elderlyflask(삼각플라스크), electrophoresis tank, comb, cuvette, parafilm,시약Plasmid DNA 분리E.coli sample, Resuspension buffer, RNase A solution, lysis buffer, Neutralization buffer, washing buffer B, Elution bufferDNA 농도 측정DNA electrophoresisPlamid DNA sample, 50X TAE(tris-acetate-EDTA) buffer – tris base 242g, acetate acid 57.1ml, 0.5M EDTA 100ml, DW 1ml, Elution buffer, agarose 0.5g, 1kb DNA ladder(size marker),DNA loading dye (bromophenol blue, xylene cyanol FF, Glycerol), EtBr, UV3.실험 목적및원리목적형질전환 된 E.coli의 cell로부터 plasmid DNA를 분리하고, 분광광도계를 이용하여 DNA의 농도와 순도를 분석한다. 또 agarose gel 상에서 electrophoresis 하여 목적하는 DNA의 rting 해주면 하얀 응고물이 생긴다.12000~13000 rpm으로 4℃에서 30min 원심분리한다.(기다리는 동안 column을 collecting tube에 setting, e.p tube도 준비하여 labeling한다.)(column 밑 부분을 손으로 만지지 않는다.)Down된 pellet을 건드리지 않고 천천히 pipette으로 상츠액을 취해 column(max 750ul)에 넣은 후 12000rpm에서 1분간 원심분리한다.Centrifuge가 끝나면 collecting tube를 버리고 Column만 e.p tube에 옮긴다.Washing buffer B 700ul를 column 안에 천천히 넣은 후 12000rpm에서 1분간 원심분리한다.(washing buffer B 사용전 ethanol 첨가)Labeling 해 놓은 새 e.p tube에 column을 옮겨 13000rpm에서 1분간 원심분리한다.(ethanol을 dry 시켜준다.)Elution buffer 35ul을 천천히 column안에 솜이 모두 젖도록 넣고, 1분간 실온에 두었다가 12000rpm에서 1분간 원심분리한다.-20℃에서 보관한다.DNA 농도 측정 (UV-vis spectrophotometer 이용)Cuvette에 elution buffer 또는 멸균 D.W를 넣고 흡광도를 측정한다. ( volume 50ul) - BlankCuvette에 분리한 DNA sample 5ul 에 45ul의 멸균 D.W를 넣고 흡광도를 측정한다. ( total volume 50ul) – sample (10배 희석)DNA electrophoresis삼각플라스크에 agarose 0.5g과 1X TAE 용액 50ml를 넣고 microwave oven을 이용하여 알갱이가 없도록 완전히 용해시킨다.용액을 50-60℃ 정도로 충분히 식힌 후 comb를 꽂은 틀에 부어준다.Gel이 굳도록 20-30분간 기다린 후 gel이 굳으면 comb를 조심스럽게 뽑는다.Gel을 전기영동 tank에 (-)charge에서 (자 클론화라고도 한다. 즉, 유전자를 가지고 있는 DNA 단편을 벡터에 클로닝하여 숙주 세포내에서 재조합 DNA 분자를 번식시키는 것을 말한다.세포 실험을 하기 위해서는 동일한 세포의 집합이 필요하다. 유전자 연구 역시 동일한 유전자가 다량 필요하다. 이렇게 동일한 유전자의 집합을 만드는 과정이 바로 gene cloning이다.클론으로 만든 유전자를 이용하여 그 유전자에 대한 여러 가지 기초연구, 유용한 물질의 생산 등 응용연구가 이루어진다.유전자 클로닝 실험의 기본적인 단계클론 되어질 유전자를 포함하고 있는 DNA 단편이 재조합 DNA 분자(recombinant DNA molecule)를 생산하기 위해 벡터(vector)라는 원형 DNA 분자 속으로 삽입된다.벡터는 유전자를 숙주세포로 운반하는 역할을 하며, 숙주세포로는 여러 형태의 세포가 있으며, 그 중에 박테리아가 일반적으로 사용된다.숙주세포 속에서 벡터는 복사되어, 자신과 완전히 동일한 다량의 벡터뿐만 아니라 그것이 운반하는 유전자도 다량 복사된다.숙주세포가 분열될 때, 재조합 DNA 분자의 복사물이 자손에게 전달되며, 거기서 벡터 복제가 일어난다.수많은 세포 분열이 일어난 후에, 동일한 숙주세포의 군락(colony), 혹은 클론이 생성된다. 클론의 각 세포는 하나 혹은 그 이상의 동일한 재조합 DNA 분자를 포함하며, 재조합 분자에 의해 운반된 유전자를 소위 ‘클론’ 되었다고 한다.[그림. 유전자 클로닝의 기본단계->]클로닝에 의한 유전자 분리클로닝이 정확하게 어떻게 유전자의 순수한 샘플을 제공하는지를 그림에 그려져 있다.이러한 예를 보면, 클론되어 지는 DNA 단편이 여러가지 다른 단편 혼합물의 한 구성원이며, 각각은 다른 유전자 혹은 유전자의 일부를 지니고 있다. 실제로 이 혼합물은 한 유기체, 예를들면 인간 전체 유전자의 보체(complement)일 수 있다. 이러한 모든 단편들은 다른 벡터 분자 속으로 삽입되어 재조합 DNA 분자 군을 생성하며 그 중의 하나가 관심 있는 유전자를 지니고 있다. 적인 유전 요소].[그림(우). 플라즈미드의 선별표식자로서 항생제 내성의 이용의 예]작은 플라즈미드는 숙주세포의 DNA 복제효소를 이용하여 사본체를 만들지만 조금 큰 플라즈미드는 플라즈미드 복제에 필요한 특별한 효소의 유전자를 지니고 있다. 플라즈미드중 어떤 것은 박테리아 염색체내에 자신을 삽입시킴으로써 복제할 수 있다. 이러한 삽입 플라즈미드(integrative plasmid), 혹은 에피솜(episome)은 수많은 세포분열 후에도 이런 형태로 유지되지만, 어떤 단계에서는 독립적인 요소처럼 존재한다.플라즈미드의 크기와 사본수플라즈미드의 이런 두가지 특징은 클로닝에 매우 중요하다. 클로닝 운반체로는 10kb 이하가 바람직하다. 플라즈미드의 크기는 최소 1.0kb-250kb 까지이기 때문에 클로닝 실험에서는 몇 개만이 사용된다. 간혹 어떤 상황에서는 큰 크기의 플라즈미드가 클로닝에 사용되기도 한다.사본수(copy number)는주로 하나의 박테리아 세포에서 발견되는 개개의 플라즈미드의 분자 수이다. 사본수를 조정하는 인잔ㄴ 잘 알려져 있지 않지만, 큰 분자는 1개 정도로 적으며 어떤 것은 50개 이상의 플라즈미드도 있다. 일반적으로 말하면, 다량의 재조합 DNA 분자를 얻기 위해서는 다량의 사본체가 세포에 존재하는 것이 유용한 클로닝 벡터이다.플라즈미드의 분류생식능(ferlity)저항(resistance) : R 플라즈미드는 ampicillin이나 수은등과 같은 1개 혹은 그 이상의 항균성제(antibacterial agent)에 저항하는 유전자를 숙주 박테리아로 운반한다.Col 플라즈미드 : 다른 박테리아를 죽이는 유전자를 포함한다.분해 플라즈미드(degradative plasmid) : 특이한 분자를 숙주 박테리아가 신진대사 하게 한다.독성 플라즈미드(virulence plasid) 숙주 박테리아에 병원성을 부여한다.DNA 분리 (Plasmid DNA 추출)박테리아 배양액으로부터 플라즈미드를 추출하는 것은 총세포 DNA 추출과 같은 일반적인 방법을 포함한다알려져 있지 않다. 왜냐하면, 이 배지를 구성하는 트립톤(tryptone)과 효모 추출물이 잘 알려지지 않은 화합물의 복잡한 혼합물이기 때문이다. 이중 트립톤은 아미노산과 작은 펩타이드를 제공하는 반면, 효모 추출물은 잘소 요구물과 당, 무가영양소, 유기영양소 등을 공급한다. LB와 같은 복합체배지는 더 이상의 첨가물이 필요하지 않으며, 여러 종(species)의 박테리아의 성장을 돕는다. 정확한 조건 에서의 박테리아 배양이 필요한 것이 아니고 단지 DNA를 얻기 위한 배양이라면 복합 배지 사용이 적당하다.박테리아 채취세포 추출물을 준비하기 위해서는, 박테리아는 가능한 부피가 적게 얻어져야 하므로 채취는 원심 분리기에서 배양액을 회전시킴으로써 가능하다. 원심 분리기를 약간 느린 속도로 맞추어 원심 분리기 시험관 바닥에 박테리아가 덩어리로 뭉치게 되면 배양배지를 딸아 버린다.[그림. 원심 분리기에 의한 박테리아 채취]이온 교환 크로마토그래피를 이용하여 세포 추출물에서 DNA 정제생화학자들은 화학 혼합물을 각각의 개별 성분으로 분리하기 위해 전하량(electrical charge)의 차이를 이용한 다양한 방법들을 고안했다. 이러한 방법 중 하나가 크로마토그래피 이온 교환 수지(resin)의 전기를 띈 입자에 얼마나 강하게 붙느냐에 따라 분자를 분리하는 이온교환 크로마토그래피이다. DNA와 RNA는 몇몇 단백질과 같이 음전하를 가지고 있어 양전하수지(resin)에 결합한다. 전기적인 결합은 염에 의해 분리되는데, 강력하게 결합된 분자들을 분리하기 위해서는 고농도의 염이 요구된다. 염의 농도를 점차적으로 증가함으로써 다양한 종류의 분자들이 차례로 수지(resin)로부터 분리된다.이온 교환 크로마토그래피를 수행하기 위한 가장 간단한 방법은 유리나 플라스틱 관에 수지를 넣고 세포 추출물을 위해서 붓는 방법이다. 추출물은 관을 통해 내려가게 되고, 이 추출물이 매우 적은 염을 포함하기 때문에 모든 음전하 분자들은 수지에 결합하게 관에 남아있게 된다. 만약 농도가 점차적으로.

자연과학| 2015.05.20| 16페이지| 2,500원| 조회(501)

플라스미드, 전기영동, DNA 농도, DNA 플라스미드, dna 농도 측정, 겔 ..

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[A+레포트] 크로마토그래피(chromatography) - HPLC를 이용한 카페인 정량

식품 기기 분석 실험 보고서1.주제HPLC (high performance liquid chromatography) : 커피, 홍차, 녹차의 caffeine 분석GC (gas chromatography) : 오렌지의 리모넨 성분 분석2.재료 및기구HPLC, 카페인 표준품, methanol, D.W, micropipette, 10ml volumetri flask, C18 카트리지, Adapter, 3ml 주사기, syringe filter3.실험 목적및원리목적HPLC로 음료(커피, 홍차, 녹차)의 caffeine을 정량할 수 있다.GC로 오렌지 껍질의 향기성분을 분석할 수 있다.원리HPLC의 작동원리는 일반적인 크로마토그래피와 매우 유사하다. 액체상태의 분석체는 칼럼 내의 정지상을 통과할 때 여러 물리화학적 친화도에 따라 머무르는 시간이 상이하고 이를 이용하여 분리하는 원리이다.LC의 칼럼은 충전식 칼럼이 대부분이며 고형의 중심체에 여러 정지상들이 코팅되어 있는 형식을 취한다.4.실험방법표준용액 만들기카페인 표준품 10mg을 100ml 부피플라스크에 넣고 전체 부피가 100ml가 되도록 30% 메탄올 수용액으로 묽힌다. ( 농도: 100ppm)마이크로피펫 ①의 용액 200, 400, 600, 800ul와 30% 메탄올 수용액 800, 600, 400, 200ul를 각각 혼합하여 전체 부피가 1ml가 되도록 한다.(농도: 20, 40, 60, 80 ppm)Calibration curve를 작성한다.시료용액 만들기50ml Beaker에 음료(커피,홍차,녹차)를 취한다.메탄올 25ml와 d.w 25ml l를 섞어 50%의 메탄올을 제조한다.음료 2ml를 메탄올과 초순수로 활성화시킨 C18 카트리지에 흡착시킨다.d.w 5ml로 세척하여 카페인 외의 불순물을 흘려보낸다.10ml 부피 플라스크에 C18 카트리지를 대고 50% 메탄올 수용액 5ml를 흘려넣어 용출(caffeine)한다.10ml 부피 플라스크의 표시선까지 초순수를 넣어 전체 부피가 10ml가 되도록 묽힌다.시여 다음과 같은 조건으로 분석ConditionColumnDetectorMobil phaseFlow rateInjection volumeZorbax Eclipse XDB-C18 (3.0 x 100mm, 3.5um)UV 280nmMethanol : water ( 30 : 70 )0.3ml/min1ul5.실험결과[사진. Beaker에 시료를 취한다. 왼쪽부터 커피, 녹차, 홍차 순][사진. C18 카트리지에 시료를 넣어 흡수시킨다. (홍차)][사진. 불순물 제거를 위해 D.w를 넣는다.][사진. 바이알에 시료를 반정도 채움][사진. HPLC ][사진. HPLC 기기에 바이알을 넣는다.]제품명커피(프리미엄 원두커피‘칸타타’)녹차(동원 보성녹차)홍차(롯데‘실론티’)음료의 부피275ml350ml240ml음료의 카페인 농도99.98ug/ml9.69ug/ml11.65ug/ml카페인의양음료 2ml에 포함된 카페인의 양계산: 분석 시료의 농도(ug/ml) x 10ml999.8ug/ml96.9ug/ml116.5ug/ml음료(전체)에 포하된 카페인의 양계산: 음료 2ml에 포함 된 카페인의 양(ug) x 음료의부피(ml)/2ml999.8 x 275/2ml= 137.47mg96.9 x 350/2ml= 16.96mg116.5x240/2ml= 13.98 mg[표1. 정량분석 결과]6.이론크로마토그래피(chromatography)분석화학 기기 중 가장 광범위하게 사용되는 기기이다. 크로마토그래피란 혼합물에서 각 성분을 분리하는 기술로서 각 성분들은 정지상과 이동상이라는 두 상(phase)사이의 분배계수에 의해 분리되는 특성을 지닌다. 흡사 크로마토그래피의 원리는 추출과 매우 유사하다고 볼 수 있다. 하지만 추출의 경우 두 상이 같은 상태로 존재하나 크로마토그래피는 하나의 상은 정지된 채로 그리고 나머지 상은 이동상태로 존재하는 것의 차이라고 볼 수 있다.크로마토그래피 원리크로마토그래피에는 반드시 2개의 상(phase)이 존재하는데 정지상(stationary phase)과 이동상(mobil팅되어 있다. LC의 경우에는 구형의 입자에 정지상이 표면에 코팅되어 있다. 어떤 경우라도 크로마토그래피의 원리는 정지상과 이동상에 포함된 구성성분들이 상호간의 결합력(여러 가지 결합력이 존재함) 또는 분배계수에 의해 차별화되어 분리되는 원리를 지닌다.액체 크로마토그래피 (HPLC, High performance liquid Chromatography)1. HPLC 시스템HPLC의 작동원리는 일반적인 크로마토그래피와 매우 유사하다. 액체상태의 분석체는 칼럼 내의 정지상을 통과할 때 여러 물리화학적 친화도에 따라 머무르는 시간이 상이하고 이를 이용하여 분리하는 원리이다.LC의 칼럼은 충전식 칼럼이 대부분이며 고형의 중심체에 여러 정지상들이 코팅되어 있는 형식을 취한다.2. 액체 크로마토 그래피의 종류여러 종류의 LC가 있는데 주로 이동상과 정지상이 무엇이냐에 따라 크게 4가지로 구분할 수 있다.Liquid/Solid Chromatogarphy (LSC: adsorption chromatography)정상 (Normal Phase) LSC역상 (Reverse Phase) LSC (거의 존재하지 않음)Liquid/Liquid Chromatography(LLC: partition chromatography)정상(Normal Phase) LLC역상 (Reverse Phase) LLC이온 교환 크로마토그래피 (Ion Exchange Chromatography)이중 LSC는 정지상이 고체인 LC를 말하는 것으로 주로 실리카를 채택하고 있다. LSC와 LLC는 다시 정상과 역상으로 나눌 수 있는데, 여기서 정상과 역상은 어떤 특별한 의미를 가진 것이 아닌 정지상이면 극성, 역상이면 비극성을 의미한다. LSC는 거의 정상만 존재하고, LLC는 정상과 역상을 모두 가지나 널리 쓰이는 LLC는 C-18으로 대표되는 역상이다.Liquid/Solid Chromatography (LSC)LSC의 칼럼은 실리카(silica: SiO2)가 대표적이다. 이 칼럼은 주로 흡착현상을 이용하는데는 영원히 흡착되어 있는 것이 아니라 극성이 강한 용매가 도달하면 그 용매에 자리를 내어주고 분석체는 자리를 떠나 칼럼을 통과하게 된다.Liquid/Liquid Chromatography (LLC)LLC는 액체 고정상을 이용하는 것으로 액체인 분석체와의 분배계수의 차이에 의한 분리를 그 원리로 하고 있다. 이 LC의 고정상은 고체 표면에 탄화수소(역상)나 여러 기능기(정상)를 화학결합으로 연결시켰다. 이를 bonded phase 크로마토그래피라고 한다.가장 흔히 접하는 HPLC 칼럼은 C-18이나 C-8등인데 이들은 역상 LLC의 대표적인 경우이다. 이와 같은 칼럼을 많이 사용하는 이유는 바로 분석체가 물에 녹는 경우 이를 분리하는데 가장 적합한 고정상이 C-18이기 때문이다.생각해보면 우리 주변의 식품관련 소재나 생물체의 구성성분은 대부분 수용성이다. 이들 분석체를 극성을 띠는 정지상이 실리카와 같은 정지상으로 분리한다면 용매로 쓰이는 물의 극성이 너무 강해 실리카의 대부분과 결합 또는 흡착할 것이다. 그러면 분석체들의 분리는 불가능 하기 때문에 이들의 분리를 위해서는 역상 LLC를 많이 사용하는 것이다.이온교환크로마토그래피이온교환크로마토그래피는 고형상의 지지대에 이온을 화학적으로 결합시킨 형태이다. 이 방법은 pH조절이 매우 중요한데 일단 양이온이 포함된 분석체를 분리하려면 초기 pH는 낮게 유지하고 시간이 경과한 후 pH를 높여주면 원래 있던 나트륨이온이 제자리를 찾아오면서 분리가 일어난다.적절한 HPLC의 선택여러 LC 중 적합한 칼럼을 선택하는 것은 분석에 있어 매우 중요하다. 일단 분석체가 정해지면 문헌을 통해 적합한 칼럼 및 운용조건을 찾는 것이 중요하다. 문헌이 존재하지 않으면 각 분석체의 특성을 파악한 후 시료 종류에 따른 LC를 참조하여 선택하는 것이 좋다.3. HPLC의 구성용매HPLC에 쓰이는 용매는 극성에 따라 다음과 같이 구분될 수 있따. 극성용매로는 물이 대표적이며 메탄올, 에탄올, 아세토나이트릴 등이 조금 낮은 극성을 보이고 있다. 즉 어떤 분석체가 고정상과 반응하여 결합되어 있는 경우 이를 다른 극성을 띤 용매가 자리를 차지하고 분석체를 밀어낼 수 있는 작용을 한다. 이는 분석체들의 머무름시간을 조절하는 매우 중요한 기능을 수행한다.이들 용매의 특성을 사용하는 LC에 따라 구분지을 수 있는 지표가 용매세기이다. 용매의 세기는 사용하는 LC가 정상이나 역상이냐에 따라 달라지는데 이에 대한 이해가 꼭 필요하다.용매 세기는 극성이 강할수록 커지며 보다 빠른 분석체 분리를 위해 용매세기가 센 용매를 사용한다. 반면 역상 LSC에서는 용매세기가 정상의 반대이다. 역상 LSC의 분리를 위해선 비극성이 강한 용매를 사용해야 한다.운용방식HPLC를 보다 효율적으로 운용하기 위한 가장 적합한 방식은 여러 용매를 사용하되 그들의 조성을 조절하는 것이다. 초기 상태의 용매 조성을 그대로 유지하는 방식을 isocratic 방식이라고 하며 시간의 경과에 따라 조금씩 용매 조성을 달리 해주는 방식을 gradient 방식이라고 한다. 예를 들어 물과 아세토나이트릴의 비율에 따라 분석체들의 머무름 시간이 달라지고 각 피크들의 해상도가 달라지는 현상을 볼 수 있다. 즉, 각 분석체들의 분리능과 머무름시간의 경제성 등의 여러 요소들을 고려하여 용매를 선택해야 한다는 것이다.인젝터HPLC의 인젝터는 매우 흥미로운 발명품이다. 로드 모드와 주입 모드, 두가지의 모드가 존재하는데, 로드 모드란 일단 샘플을 HPLC 주입기에 주입하는 과정에서 필요한 동작을 말한다. 주입기는 모두 6개의 통로가 있어 이들 통로를 통해 샘플이 주입되는데, 핵심은 정확한 양을 주입하기 위해 루프를 사용한다는 것이다. 루프의 종ㄱ류에는 주입되는 샘플의 양에 따라 다양하다. 10uL, 20uL, 100uL등 다양한 종류가 있다. 로드 모드에서는 일단 정해진 양이 루프에 채워지게 되고 주입 모드로 돌리면 마침내 루프에 있던 시료가 칼럼으로 들어가게 된다.검출기GC 검출기와는 달리 HPLC 검출기는 주로 분광기의 원리를 이용하는 것이 대부분이다. 따라

자연과학| 2015.05.20| 9페이지| 2,000원| 조회(715)

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[A+레포트] 위암 레포트 (이론, 발표자료)

위암(胃癌, gastric cancer)목차위암의 정의 (3~5.p)위암의 원인 (5~9.p)위암의 진행 단계 (9~10.p)위암의 증상 (10.p)위암의 진단 (10~12.p)위암의 치료 (12~22.p)수술 요법수술 후 보조요법영양 요법위암의 예방 (21.p)참고문헌 (22.p)1. 위암의 정의위에 생기는 악성 종양에는 위 점막상피에서 생기는 위암과 점막하층에서 생기는 악성림프종, 근육육종, 간질성 종양 등이 있으나, 대개 위암이라 하면 위선암을 일컫는다. 위암은 위장 점막 조직에서 발생한 세포가 선암성 변화를 보이면서 종괴(종양 덩어리)를 만들거나 악성 궤양을 만드는 암으로, 위의 가장 안쪽을 싸고 있는 점막에서 발생하여 혹의 형태로 커지면서 주로 위벽을 관통하고, 위 주위의 림프절로 옮겨가서 성장한다.①위의 위치 및 구조② 위의 기능위는 횡격막의 바로 왼쪽아래에 위치하는 소화기관 중에서 가장 큰 부분이다. 식도와 연결되는 부분을 분문[cardia], 십이지장과 연결되는 부분을 유문[pylorus]이라 하며, 위저부[fundus], 위체부[body], 및 유문부[pyloric region]로 구성되어 있다.위의 중요한 역할은 음식물을 일단 머무르게 하는 저장고로서 소화가 이루어지는 과정에서 음식물을 받아들이고, 그것을 보유하였다가 변화된 물질을 장으로 보내는 기능을 한다.③ 암 종별 발생현황2008년 가장 많이 발생한 암은 위암이었으며, 갑상선암, 대장암, 폐암, 간암, 유방암, 전립선암의 순으로 많이 발생하는 것으로 나타났다.- 남자의 경우 위암, 대장암, 폐암, 간암, 전립선암 순이었으며, 여자의 경우 갑상선암, 유방암, 위암, 대 장암, 폐암 순이었다.[성별 10대 암 조 발생률, 2008년]④ 위암관련통계2010년에 발표된 한국중앙 암 등록본부 자료에 의하면 2008년에 우리나라에서는 연 평균 178,816건의 암이 발생되었는데, 그 중 위암은 남녀를 합쳐서 연 평균 28,078건으로 전체 암 발생의 15.7%로 1위를 차지했다. 인구 10만 명당agotomy)만 시행한 경우에는 위암 발생과 연관이 없다.- 위점막 내 병변위염 (gastritis)만성 위축성 위염위축성 위염은 만성적인 염증 반응으로 인해서 위 점막이 혈관이 보일 정도로 얇아지면서 소화 효소를 분비하는 위샘이 파괴된 상태를 말한다. 상태가 악화되어 화생성 위염이 된다.화생형 위염, 장상피 화생 (metaplastic gastritis)위축성 위염이 악화된 상태로 말할 수 있다. 화생성 위염은 위 점막이 오랫동안 안 좋은 자극을 받아서 원래 모습을 잃고 소장 점막이나 대장 점막 모양으로 변한 경우(이런 이유로 화생성 위염을 ‘장상피화생(腸上皮化生)’이라고도 한다)를 말하는데 내시경상으로 위점막에 무수한 융기를 볼 수 있으며, 위벽이 붉지 않고 회백색의 색조를 띄게 된다. 심한 만성 위축성 위염 환자의 10% 이상에서 암이 발생하며, 위암까지 진행되는 데는 16~24년 정도 걸리는 것으로 보고돼 있다.위용종 (gastric polyp)위의 점막표면의 일부가 혹처럼 위로 솟아오른 것을 말한다. 위 용정에는 암으로 변할 수 있는조직인 선종, 암세포가 포함된 용종인 암종, 그리고 암과 유사한 임상경과를 보이는 유암종 등이 있다. 그 중에서도 선종성 용종이 위암발현에 가장 큰 영향을 끼친다.선종성 용종보통 0.5-5cm로 일반적으로 다른 종류의 용종 보다 크다. 2cm 이상이면 선암으로 발전할 가능성이 있기 때문에 주의해서 관찰해야 한다.-악성빈혈(Pernicious anemia)악성 빈혈이란 거대 적아구성 빈혈 중 하나다. 거대 적아구성 빈혈의 종류에는 비타민 B12를 충분히 섭취하지 않아 생기는 빈혈과 비타민 B12를 섭취해도 이를 흡수할 수 있는 내인자가 부족해 빈혈이 생기는 빈혈이 있다. 비타민 B12를 흡수할 수 있는 내인자는 위에서 분비하는데, 위가 어떤 이유에서든 내인자를 분비하지 않아 생긴 빈혈이 악성 빈혈이다.내인자가 분비되지 않는 이유는 대부분 위축성 위염이 있거나 아예 위를 절제했기 때문인 경우가 많다. 두 가지 모두 위암과 밀사용되지는 않고, 위암의 원격전이가 의심되지만 CT나 MRI 등 다른 검사로는 확진이 애매한 경우나 기존 검사법들로는 위암의 재발여부를 알 수 없는 경우 등에서만 사용된다.종양표지자 (Tomor marker)종양표지자란 암세포의 발육에 대한 지표가 되는 물질들로, 여기에는 암세포가 직접 생산하는 물질도 있고, 암세포와 반응하여 체내의 정상세포가 만드는ㅁ 루질도 있다. 이들 물질은 체내에 암이 발생할 경우 혈중농도가 상승하였다가 암이 제거되고 나면 농도가 떨어지는데, 만약 암이 재발하게 되면 혈중농도가 다시 상승하게 될것이므로 이들 종양표지자의 혈중농도를 측정함으로써 암을 진단하거나 재발 여부를 확인할 수 있는 것이다. 가장 대표적인 종양표지자는 대장암의 진단과 추적관찰에 사용되는 CEA라는 물질과, 간암의 진단과 추적관찰에 사용되는 α-FP라는 물질이다. 위암에서도 CEA, Ca19-9, CA125, TPA, α-FP 등이 연구중에 있지만, 다른 암과 달리 위암 환자에서 이들 종양표지자의 양성률은 10~20%에 불과하므로 아직 위암의 진단이나 추적관찰에서 효과적으로 사용되고 있지는 못하다.위암은 초기에 별다른 증상이 없어 발견이 어려운 질병이지만 위 점막층에서부터 종양이 자라 들어가기 때문에 내시경검사만 받으면 오히려 쉽게 진단된다. 위암을 진단하기 위한 최선의 검사법은 위 내시경검사이며, 상부위장관촬영, CT, 초음파 등 다른 검사들은 보조적 역할을 할 뿐이다. 위암을 최종적으로 ‘확진’하기 위해서는 내시경 검사를 통해 암이 의심되는 부위에서 조직을 채취하여 염색한 후 현미경으로 암세포의 유무를 확인(조직검사) 하여야 한다.위암의 치료 (수술, 보조, 영양)< A. 수술 요법>위암 치료의 가장 중요한 핵심은 ‘조기에 발견하여 수술을 하는 것’이다.다른 고형암들도 마찬가지겠지만, 위암은 수술만이 위암환자의 생존율을 늘일 수 있는 유일하게 입증된 방법이다. 따라서 위암을 진단받으면 1차적으로 수술을 고려해야 하며, 우선시 해야 한다.1. 수술적 치료의 원칙1) 되는 것으로 발생 근원에 따라 자연 방사선(태양, 땅, 음식물, 우주 등에서 나오는 가시광선, 적외선 등) 인공 방사선(가전 제품, 진단용 X-선 장치, 암치료 장비 등에서 발생)으로 나눌 수 있다. 이 중 감마선, X-선, 전자선, 양성자선, 중성자선이 암 치료에 많이 사용되고 있다.방사선은 세포분열이 활발한 세포를 잘 파괴하는 장점이 있지만 위암세포는 방사선 감수성이 작은 것으로 알려져 있다. 현재 국소적으로 진행된 위암 환자에서 수술이나 항암 치료를 시행할 수 없는 경우에 시도 되고 있다.1)치료 기전:방사선을 세포에 조사하면 방사선이 세포의 생존에 필수적인 기관인 DNA와 세포막에 직접 혹은 간접적으로 작용하여 세포를 죽이는 것으로 알려져 있다. 방사선을 받은 세포는 대부분 그 이후에 세포 분열을 할 때 죽고, 일부 세포는 세포가 노화되어 정상적으로 수명을 다하는 세포 사멸(Apoptosis)이라는 과정을 통해 죽게 된다.방사선 조사를 받으면 정상 조직과 암 조직에서 모두 방사선으로 인한 장애를 일으키게 된다. 정상 조직은 어느 정도의 시간이 지나면 장애로부터 회복되지만, 종양 조직은 어느 정도 기간 동안 충분한 회복이 불가능하다. 그러므로 이를 고려해 하루에 180~200cGy씩 장기간 분할 치료를 하면 정상 조직의 방사선 장애를 최소화하면서 종양 조직의 파괴는 높여 효율적인 치료가 가능하게 된다.2)방사선 치료의 발달3)치료 방법에 따른 방사선 치료의 분류외부 방사선(원격)치료선형가속기를 이용하여 만든 고에너지의 X-선이나 전자선을 환자의 피부에 통과시켜 몸 내부에 있는 종양까지 도달하게 하여 암세포를 죽이는 방법이다. 치료 시 통증은 전혀 없으며 1회 치료시간은 5분 이내이고, 전체 치료 기간은 치료 목적이나 방사선에 대한 병의 민감도에 따라 다르다. 초기에는 종양 부위와 암세포가 퍼져있을 가능성이 높은 부위를 모두 포함한 넓은 영역을 치료하지만, 몇 단계에 걸쳐 치료 계획을 바꾸어 치료 영역을 점차 줄여나가다가 마지막에는 종양부위에만 방사선을 조.b. Appetite stimulantsc. Diets with foods that are high in calories and protein④ Nutrition Support from Clinical Experts Who Understand Your Needsa. Identify the nutrition options which put you at the least risk for malnutritionb. Address mobility of food/digestion issuesc. Identity food that is easy for you to digestd. Recommend foods and spices that help you minimize nausea and vomiting⑤ Helping you choose the right post-treatment diet유동식에 환자가 완전히 익숙해지고 치료가 끝난 후에는 임상영양사가 연한 음식에서 고체 음식으로 먹을 수 있도록 결정 해야한다. 예를 들면, 단백질 쉐이크에서 보통 음식으로 변화시킬 것이다. 환자는 더욱 자주 먹어야 하고 못 먹던 음식도 먹도록 노력해야 한다.4. 해외의 위암발생 위험요인과 영양①우루과이의 위암 위험요인과 식사패턴식사는 위암 발병의 주요 요인이다. 이러한 이유를 바탕으로 1000명의 사람을 대상으로 음식을세개의 그룹으로 나누었다. "starchy," "healthy," 그리고 "mixed." 그룹이다. Starchy 그룹의 사람들은 주로 쌀, 짠 육류, 쇠고기 스튜, 흰 빵, 감자 그리고 식물줄기를 주로 먹었는데 이러한 사람들은 위암의 발병 위험이 더욱 높아졌다. Ascorbic acid와 카르티노이드가 풍부한 채소와 과일을 주로 먹는 Healthy 그룹의 사람들이 가장 발병 위험이 낮았고, Mixed 그룹은 중간 정도였다. 그러므로 풍부한 채소와 과일을 섭취하고 짜고 탄수화물이 많은 음식은 피해야한다.② 멕시코시티의 위암 위험요인과 식사패턴위암이 걸렸거나 걸린 적이 있1

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[A+레포트] 단백질 분리 (SDS-PAGE), 단백질 전사(western blot법)

영양 생화학 실험실험일:학번:이름:제출일:실험조:1. 주제SDS-PAGE & Western blot2.재료및기구기구SDS-PAGESample( 9개 - control군, curcumin 저농도 및 고농도 처리군)Glass plates (short plate, tall plate) , casting frame , casting stand, 3M paper,전기영동 tank, pipette (1000ul, 200ul, 20ul), power supplyer,kims wiper, conical tube, e.p tube, vortex, slicon glove, racker, thermobath,Western blotTransfer kit (N.C paper, sponge, 3M paper, transfer buffer, ice pack, blocking buffer), wrap, cassette, X-ray film, kims wiper, conical tube, e.p tube, vortex, slicon glove, racker, thermobath,시약SDS-PAGESeparating gel component, stacking gel component, running buffer, 6x SDS loadingdye, protein markerWestern blotPrimary antibody(c-jun), Secondary antibody(rabbit), ECL solution, PBST, developer solution, fixer solution, blocking buffer (skim milk 5% in PBST), trasfer buffer3.실험 목적및원리목적SDS-PAGE 에 의한 단백질 분리 및 Western blot원리SDS – PAGE (Sodium dodecylsulfate – Polyacylamide Gel Electrophoresis)SDS-PAGE는 단백질의 순도 검정이나, 단백질 분리, 단백질 분자량 측정 등을 위해 실행하는 기법이다.4KH2PO40.24DDW 800ml에 1X PBS component 시료 넣은 후 pH 7.4 맞추고 DDW 1L로 채운다.SDS – PAGE기기:전기영동 준비 (설치)준비물: Glass plates (short plate, tall plate) + casting frame + casting stand, 3M paperTall plate 위에 short plate를 올려서 겹친다.Casting frame에 껴 넣어 고정시킨다.(Plate의 바닥이 평평하게 고정되어야 누수되지 않는다.)그 상태로 casting stand에 눌러서 고정시키고 물기가 있다면 3M paper로 제거한 후 설치를 마무리한다.Gel 제조구성 목록용량 (ml)H205.161.5M Tris (pH 8.8)340% polyacrylamide3.610% SDS0.1210% APS0.12TEMED0.0048표의 조성대로 gel을 제조한다.(TEMED는 가교제로서 가장 마지막에 넣고 vortexing을 오래하지 않도록 주의한다.)glass plate(1mm)에 gel을 넣을 때 한쪽에서 기포가 생기지 않도록 주의하며 glass plate의 위에서 2cm정도 아래까지만 separating gel을 주입한다.gel 주입이 끝나면 butanol을 넣고 gel이 굳을 때 까지 20-30분 기다린다.(*butanol : gel의 건조를 막고, start line을 평평하게 한다.)Gel이 굳으면 butanol을 버리고 D.W로 헹구어 준 후 3M paper로 물기를 제거한다.구성 목록용량 (ml)H202.921M Tris (pH 8.8)0.540% polyacrylamide0.510% SDS0.0410% APS0.04TEMED0.004표의 조성대로 gel을 제조한다.(TEMED는 가교제로서 가장 마지막에 넣고 vortexing을 오래하지 않도록 주의한다.)glass plate(1mm)에 gel을 넣을 때 한쪽에서 기포가 생기지 않도록 주의하며 glass의 short plate의 끝 부분 까지 gel을 주입ernight한다.(2조: PBST로 1/1000희석한 c-jun)PBST로 10분씩 3번 washing한다.Secondary antibody을 넣고 실온에서 1시간 진탕한다.(PBST로 1/1000희석한 secondary A.b = rabit)PBST로 10분씩 3번 washing한다.감광 및 현상ECL(enhanced chemiluminescence)용액을 이용해서 Develop한다.(ECL kit 의 solution A와 B를 1:1로 섞어 membrane에 부어준 후 1분간 기다린다.)wrap으로 membrane을 잘 싸서 cassette에 넣은 후 X-ray film과 함께 암실에서 감광시킨다.(10초부터 감광시간을 두고 결과가 band에 나오지 않으면 감광시간을 점점 늘린다.)Deveolper 용액에 담가 band가 까맣게 나오면 증류수로 헹구어 준 후 fixer용액으로 band를 고정시키고 DW로 씻어 말린다.5. 실험 결과Gel 제조 ( separating gel + stacking gel)Sample 제조 (sample : 6X loadingdye + D.W + sample ) & sample 99℃가열 in thermobathElectrophoresis - LoadingElectrophoresis - Running (in 100V)준비 – transfer kitElectrotransferPonceau 염색1차, 2차 antibody 접종ECL 처리감광현상분석 (일반적인 현상 사진)5. 이 론전기영동 (electrophoresis)전기 영동법은 아미노산, 뉴클레오티드, 단백질과 같은 하전 된 물질을 정제, 분리하거나 분자구조를 분석하는데 사용된다.전기영동은 전기장을 이용하여 하전된 입자를 양극 또는 음극 쪽으로 이동시키는 현상을 말한다. 이 때 이동하는 속도는 입자의 전하량, 크기와 모양, 용액의 pH와 점성도, 용액에 있는 다른 전해질의 농도와 이온의 세기, 지지체의 종류 등 여러 가지 요인에 의해 결정된다. 그러므로 어떤 용액에서의 하전된 리하는데 적당한 겔이 된다. 때문에 start line을 맞춰주기 위한 용도의 staking gel이 5%로, separating gel의 12%보다 농도가 낮은 이유도 여기에 있는 것이다.Protein markerprotein marker는 분자량을 알고 있는 단백질을 gel의 한쪽 well에 전기 영동 시켜서 gel을 염색 했을 때 다른 단백질의 크기를 알기 위해 사용하는 standard의 역할을 한다.Western blot원리SDS-PAGE 방법으로 분리된 단백질을 나이트로셀룰로오스 종이로 옮긴다. N.C paper 위의 단백질 중 표적 단백질에 대한 항체를 이용하여 항원-항체 반응으로 그 단백질을 확인한다. 표적단백질에 대한 항체(1차항체)와 1차 항체에 대한 항체(2차 항체)로서 표지가 결홥된 항체가 요구된다.Western blotting은 SDS-PAGE를 행한 후, 단백질을 membrane에 전사하고, 항체를 이용해 특정의 단백질을 검출하는 방법이다. 목적의 단백질에 대한 항체를 가지고 있으면, 이 방법으로 검출하는 것이 가능하다.단백질을 전사시킨 membrane은 Ponceau S 염색하여 전사가 잘 되었는지를 확인 한 후 짧게 잘라 항체와 반응시키는 것도 좋다.항체와의 결합 전에 항체와의 비특이적 결합을 방지하기 위해 blocking처리를 하게 되는데, Blocking은 여러 가지 용액이 이용되지만, 최초의 선택으로서는 1~3%의 BSA나 gelatin을 함유한 Tween-PBS 또는 단순히 Tween-PBS가 적당하다. Tween과 같은 계면활성제는 membrane의 소수성의 부분에 흡착하고 이것을 효과적으로 block한다. Skim milk(1~5% in Tween-PBS)는 blocking이 보다 강력하기 때문에 잘 이용 되어지지만, 특이적 반응까지 억제해 버리는 경우도 있다.Blocking이 끝나면 일차 항원과 반응시킨다. 이때 항체의 농도가 너무 높으면 관계없는 단백질과 비특이적으로 반응하기도 하고, membrane이 오염되기도 한다.,3-4)을 사용하였다.이러한 분석 실험을 하기 위해서는 우선 단백질 sample을 변성시켜야 한다. 단백질은 20개의 아미노산이 펩타이드 결합을 하고 있는 고분자 화합물로서, SDS(계면활성제)나 2-mercaptoethanol(환원제)를 넣어 고온에서 가열 해야 4차 구조의 단백질을 (-)charge로 하전 시키며 1차 구조로 풀리게 되어 분자량에 의해서만 분리가 가능해진다.첫 번째 실험 SDS-PAGE는 gel상에 단백질을 분자량(size)에 따라 분리하는 과정이다. (-)charge로 하전 된 단백질에 전기장을 걸어주면 acylamide gel상에서 분자량(size)에 의해 분리되고, 이 분리된 시료는 protein marker을 standard로 하여 크기와 위치를 확인 할 수 있게 된다. 이번 실험에서도 역시 gel을 만드는 과정부터 시작하여, 변성시킨 sample을 Loading하고 Running 하였다.이렇게 분리시킨 gel상의 단백질을 사용하는 것이 두 번째 실험 western blotting이다.Western blotting은 항원-항체 반응을 통해 목적하는 단백질을 x-ray film상에 현상시켜 위치, 크기, 존재 여부 등의 분석을 할 수 있게 하는 실험이다.우선 SDS-PAGE에 의해 분리된 gel상의 단백질을 membrane(N.C paper)로 전기 이동 시키고 ponceau 용액으로 transfer를 확인한 후 다시 5% skim milk 등으로 blocking한다. 그 후 항원-항체 반응을 이용해서 목적하는 단백질에 대한 1차 항체를 주사하고 일정시간 이후 2차 항체를 적용한다. 그 후에 암실에서 감광하기 전, ECL 용액으로 처리하는데 이 과정에서 2차 항체에 있는 HRP(효소)가 H2O2 존재 하에 반응하여 화학적인 발광을 하게 된다. 이것을 cassette에 넣어 일정 시간 기다리면, 빛에 의해 X-ray film이 타게 되면 고정액에 넣어 line을 고정시키고 현상하여 x-ray film상의 결과를 분석하여 목적하는 tar5.

자연과학| 2015.05.20| 15페이지| 2,500원| 조회(791)

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