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육아종성 수막뇌염 (GME)에 대한 자료

..PAGE:1GranulomatousMeningoEncephalitis..PAGE:2GME란?개의 CNS 비화농성 염증성 질병국소적 다발적인 신경계증상, 시각상실괴사성 뇌수막염과는 다름개의 CNS 질환 중 5~25%전세계적 발생..PAGE:3GME의 원인특발성감염성종양성자가면역성→ 별아교세포에 대한 자가항체..PAGE:4어떤 개에게 자주 발생할까?발생나이 : 6개월 ~ 12년령SpeciesToy 종 , Terrier 종 , 작은 종성별 : 암컷 > 수컷..PAGE:5GME의 병리는?병변위치백색질, 회색질, 뇌막현미경적 소견관찰부위 : 뇌, 척수의 실질과 뇌막림프구, 큰포식세포, 형질세포 혈관주위침윤기타 특징시각신경의 확장..PAGE:6조직학적 소견1. 림프구 → 혈관 침윤2. 큰포식세포 → 혈관 내 침윤3. 큰포식세포 → 혈관 주위 침윤4. 혈관 주위 침윤세포1234..PAGE:7조직학적 소견Fig 1. Brain stem. Coalescing perivascular cuff (H&E, x100)..PAGE:8조직학적 소견Fig 2. Brain stem. The cuffs consist of lymphocytes, macrophages and few plasma cells (H&E, x200)..PAGE:9조직학적 소견Fig 3. Numerous CD3 positive T cells within perivascular cuff(IHC, x200)..PAGE:10형태학적 분류1. 산재성 형태2. 국소적 형태3. 안구병변 형태..PAGE:11형태학적 분류1. 산재성 형태급성발병시각신경, 앞뇌, 소뇌, 척수신경, 뇌막두 개 이상의 병변신경 증상, 고열뇌척수액 : 세포증가증..PAGE:12형태학적 분류2.국소형태서서히 발병하고 진행됨하나의 중심 병변 퍼져나감임상증상앞뇌 : 행동과 정신상태 변화중뇌 : 빛에 반응하지 않음다리뇌, 연수 : 마비소뇌: 뒤뚱 걸음..PAGE:13형태학적 분류..PAGE:14형태학적 분류3. 안구형태드물다급성발병, 시신경 염증 시각상실눈보개검사 : 충혈, 부종성 디스크,(안저검사) 이완된 혈관, 국소적 출혈 관찰정상상태망막출혈상태..PAGE:15임상증상은?병의 심각도와 병변의 위치에 따라 다양함신경적 기능장애발작, 침울, 운동실조, 시력상실, 머리기울임, 선회, 고유감각결손..PAGE:16GME의 진단가진환축의 인상서와 임상증상, 뇌척수액 분석, 영상진단(CT&MRI), 다른 염증성 질환의 배제확진뇌의 생검, 부검..PAGE:17GME의 진단1. 뇌척수액 분석높은 단백질 함량유핵세포수의 증가..PAGE:18GME의 진단2. 영상진단병변부위 : 회색질..PAGE:19GME의 진단..PAGE:20GME의 진단3. 뇌생검뇌수술법흔하진 않지만 유용..PAGE:21GME의 치료목적염증 반응 억제기능적 신경 상태의 회복통증 억제발작 예방약물의 분류면역억제효과항암효과..PAGE:22GME의 치료효과..PAGE:23GME의 치료약물1. Glucocorticosteroid- 면역억제효과- 영구적 회복을 위한 예후는 좋지 않음.2. Cyclosporine- 면역억제효과- BBB 투과율은 작으나 접근가능3. Procarbazine- 항암효과- 지용성, BBB통과가능4. Cytosine arabinoside- 면역억제효과 및 항암효과..PAGE:24참고문헌육아종성 뇌수막염(GME)의 최신치료법, 정동인 외, 대한수의사회지2006/6

의/약학| 2011.02.08| 24페이지| 2,000원| 조회(455)

뇌수막염, 개, GME, 신경질환, 수막뇌염, 육아종성, Granulomatous ..

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신장의 수분 전해질균형 조절기능 에 대한 실험보고서

Purpose : 소변의 양, 용매의 농도, 그리고 전해질의 양이 혈액의 조성과 양을 일정하게 유지하기 위해서 어떻게 조절되고 있는지에 대해 알아보고 이와 관련된 호르몬과의 연관성에 대해 이해한다.Materials : 소변채집용기, urinometer, droppers, pH paper, 20% pottasium chromate, 2.9% silver nitrate, salt tabletMethod:1. 실습시작 전에 두 그룹으로 나누고 이들은 소변을 채집하여 이것을 control로 사용하여 분석한다. (소변을 받을 때 중간뇨를 받기)2. 1그룹은 500ml의 물만을 섭취하고 2그룹은 salt tablet과 물 500ml를 섭취한다.3. 다음 2시간동안 30분마다 소변을 채집하여 4에 설명한 것과 같이 분석한다.①pHpH검사용지를 소변에 담가 color chart에 표시된 색깔과 일치하는 색깔을 보고 소변의 pH를 결정한다.②비중 (specific gravity)프리즘 위에 뇨를 1~2방울 떨어뜨린다.->덮개를 살짝 덮는다. -> 형광등 바라보면서 비중계의 눈금을 읽는다.③염소의 농도ⅰ) 소변 10방울을 시험관에 떨어뜨린다.ⅱ) 다른 dropper를 이용하여 20% pottasium chromate 1방울을 ⅰ)의 시험관에 떨어뜨린다.ⅲ) 3번째 dropper로 2.9% silver nitrate 용액을 첨가하는데 시험관을 계속 흔들면서 1방울씩 떨어뜨린다. 이 때 용액의 색깔이 노란색에서 갈색으로 변하는데 몇 방울이 필요한지 알아본다.

의/약학| 2011.02.08| 1페이지| 1,000원| 조회(264)

신장, 항상성, 생리학, ADH, 전해질, 삼투압, 콩팥, 알도스테론, urinomet..

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소변검사와 현미경 관찰 에 관한 실험 보고서

Title: 소변검사와 현미경 관찰Materials: 현미경, 소변 채집용기, 현미경 slide, cover slip, droppers(10cc syringe), multistix 10G, Sternheimer Malbin stain, 원심분리기와 15ml cornical tube, pasteur pippetMethod:1) 소변을 채집한다. 용기에 최소 3/4정도 되도록 받기2) 모은 뇨를 잘 흔들어 주고 스트립의 시험부분을 뇨에 침지시킨 후 꺼낸다.3) 과량의 뇨를 용기 테두리를 이용하여 제거하고 스트립을 수평으로 잡는다.4) 라벨의 비색표와 색을 비교한다. 각 검사에 대한 적절한 판정시간 및 비색단계를 잘보고 검사하기.①Leukocyte②Nitrate③Urobilinogen④Protein⑤pH⑥Blood⑦Specific gravity⑧Ketone⑨Bililubin⑩Glucose5)소변 침전물의 현미경 소견ⅰ. 15ml tube에 5ml 정도 소변을 채워서 3000rpm으로 5분간 원심분리.ⅱ. 상층액을 버린다. (Pasteur pipet을 이용하여 바닥의 침전물에 주의하면서 제거)ⅲ. Sternheimer-Malbin solution을 한방울 떨어뜨리고 tapping으로 잘 섞어준다.ⅳ. 슬라이드 글라스에 한 방울 점적하여 커버 글라스를 덮어 400배로 관찰한다.Check Point1) 소변의 단백질, 포도당, 케톤체, 빌리루빈 등의 농도와 비색단계를 관찰하기우리조의 피실험자 2명 모두 정상범위의 색변화를 나타냈다.정상적인 소변에서의단백질 농도 : 10mg/dl 이하포도당 농도 : 0~0.8 mmol/l케톤 : 불검출빌리루빈 : 3 umol/l(2) 이러한 성분들이 비정상적으로 증가하게 되는 병리적 상황-소변에서의 단백질 농도의 증가:병적인 상황은 colic, liver cirrhosis, plasmacytomia, cardiac insufficiency, pyelonephritis, glomerulonephritis 등으로 인해 단백뇨가 관찰 될 수 있 여과값이 포도당 재흡수값의 임계치를 넘게 되어 재흡수를 100%하지 못하여 소변에서 포도당이 검출된다.-소변에서의 케톤체 농도의 증가:정상적으로는 케톤이 검출되어서는 안된다. 케톤은 포도당 대신 지방을 산화하여 에너지를 낼 때 생성되는 물질로 몸에 축적되었을 경우 매우 해롭다. 당뇨병이나 인슐린의 과다투여, 극심한 다이어트나 식이조절, 굶주림으로 인한 영양결핍, 메스꺼움과 구토, 심한 스트레스, 감염으로 인한 심한 열로 인해서 소변에서 케톤이 검출 될 수 있다.-소변에서의 빌리루빈 농도의 증가:간염과 간경화, 담즙관의 폐쇄, 간손상, biliary tree의 폐쇄로 인해서 이상 검출 될 수 있다.(3) 소변내 침전물의 정상소견을 설명하고 현미경에서 관찰되는 소견을 설명요침사현미경검사의 정상치 범위* 적혈구: 3개 이하/고배율 시야* 백혈구: 5개 이하/고배율 시야* 상피세포: 5-15개/고배율 시야그 외에 다양한 무정형 결정체와 뇨산, 원주체 등이 관찰 될 수 있다.신장에서 생성되는 원주형 구조(cylindrical structures) 신원(nephron)의 원위 세뇨관 및 집합관에서 생성되어 소변을 통해 배설된다. 신세뇨관에서 분비되는 Tamm-Horsfall점액단백질(mucoprotein)이 침전되어 만들어지며 단백뇨가 있을 때는 알부민에 의해 만들어지기도 한다.원주체는 요류 저하, 농축된 염, pH가 낮은 상태 등 단백질 변성 및 침전이 일어나기 쉬운 여건에서 잘 만들어진다. Tamm-Horsfall protein이 이와 같은 조건하에서 쉽게 침전되기 때문이다. 원주체는 원위 신세뇨관 및 집합관에서 생성되기 때문에 원주형태를 취한다. 점액 단백질을 기질로 하여 여러 가지 성분이 점액 단백질 내에 포함되거나 부착되어 다양한 원주체가 생성된다?A) 무세포성 원주체(Acellular casts)?1) 유리(초자체) 원주체(Hyaline casts)?가장 흔한 원주체이며 신 세뇨관 상피 세포에서 분비되는 Tamm-Horsfall 점액 단백질이 고형화된 것이다다. 굴절 지수가 낮아 밝은 빛 현미경 검경으로 놓치는 일이 많고 신선한 소변이 아닐 때는(채뇨부터 검경까지 시간 경과) 이 원주체가 용해되어 찾기 어렵다. 그러나 위상차 현미경 검경을 하면 쉽게 찾아낼 수 있다. Hyaline cast 내에 다른 성분이 포함되거나 부착되어 여러 종류의 원주체를 생성한다.?2) 과립 원주체(Granular casts)유리 원주체 다음으로 흔히 관찰된다. 세포성 원주체(cellular cast)의 분해 및 퇴행, 혈장 단백질(알부민) 응집, 면역 글로블린의 light chain 등이 granular casts를 형성한다. 기질 내 포함된 과립의 크기에 따라 fine granular cast와 coarse granular cast로 나누지만 임상적 의미는 없다. 보통 한 시야당 원주체 숫자로 표시한다. 만성 신질환, 단시간 내 격렬한 운동, 스트레스, 탈수, 열성 스트레스 때 유리(초자) 원주체(hyaline cast)와 더불어 나타나기도 한다. 일반적으로 시가(cigar) 형태를 취하며 굴절 지수는 hyaline cast보다 더 높다. 밝은 현미경 시야에서는 무색 또는 노란색이다. 그러나? 염색 방식에 따라 색깔이 달라진다. 모든 신장 질환, 스트레스, 급성 신부전의 회복기에 나타난다.3) 밀랍 원주체(Waxy casts)원주체 진화의 최종 산물이다. 신부전 등 장기간의 신 질환이 있어 소변의 흐름이 늦어질 때 생성된다.신장의 병적 상태에서 요류가 정체되면 신세뇨관 및 집합관의 직경이 확장되기 때문에 Waxy cast의 크기는 hyaline cast보다 크기 마련이다. 굴절 지수가 매우 높고 경도(단단한 정도)가 있어 가장자리가 예리하고 부러지기도 한다. Waxy casts는 broad cast의 범주에 속한다. Broad cast는 신세뇨관 및 집합관 직경이 커져 생긴 폭이 넓은 cast를 총칭하는 어휘이다.밀랍 원주체가 존재하면 신 세뇨관 손상, 신 세뇨관 정체(stasis), 심각한 병적 소견을 의미한다. 만성 신부전, 신 띤다.Sternheimer-Malbin 염색하면 분홍색으로 나타난다.Renal failure cast라고 한다.???Broad casts는 신 세뇨관 내에서 소변 흐름이 더딜 때 나타나며 예후가 좋지 않다. 원위 세뇨관이 확장 또는 위축되거나 집합관이 확장될 때 나타난다. granular cast 및 waxy cast가 흔히 broad cast로 관찰된다. Broad casts의 폭은 전형적인 원주체에 비해 2~6배 정도 더 크다. Broad cast는 Renal failure cast라고도 한다.?4) 지방 원주체(Fatty casts)지질을 다량 함유한 상피 세포가 파괴되어 생성된다. 지방구(fat globule)를 포함한 hyaline cast이며 노란 색깔을 띤다. 콜레스테롤이나 콜레스테롤 에스터를 포함하면 극광하에서 “Maltese cross” 싸인을 나타낸다. 고 단백성 신 증후군, 당뇨병성 또는 루푸스 신 장애등 때 나타난다. 염색으로 확인된다.[1] 원주체 내에 여러 크기의 지방적을 포함한다.[2] 원주체 기질은 hyaline 또는 과립 타입이다.[3] 단백뇨를 동반할 수도 있다.[4] 주변에 유리된 지방적이 보이기도 한다[5] 흔히 알부민 뇨를 동반하기 때문에 흔들면 거품이 일어난다.지방 원주체는 (1) 신 증후군 (2) 지질괴사 (3) 당뇨병성 신장 이상 (4) 루푸스성 신장 이상(lupus neuropathy) (5) 만성 신기능 장애 (6) 신 세뇨관 세포사때 나타난다. 1 시야당 숫자로 표시한다.?5) 색소 원주체(Pigment casts)대사 분해 산물이나 약물 색소가 부착되어 생성되며 색깔에 따라 명명된다.Pigments는 신체 내에서 생성된 소변 색소이며 용혈성 빈혈 때 나타나는 헤모글로빈, rhabdomyolysis때의 마이오글로빈, 간질환 때의 bilirubin 등이다. Phenazopyridine 등의 약물 색소는 원주체에 색깔을 부여한다.(1) 빌리루빈 (2) 헤모글로빈 (3) 마이오글로빈(myoglobin), (4) ph루빈일 때는 간염의 지시자일 수 있다. Phenazopyridine 등 의약품에 의한 착색일 때는 현재 치료 중임을 시사하며 임상적 의미를 부여하지 않는다.?6) Crystal castsCrystal casts는 신 세뇨관 강에서 hyaline cast 기질에 용질이 침전된 상태이다. oxalates, urates, sulfonamides등 소변 내에서 결정화된 용질이 hyaline cast 생성 중 그 기질 내에 걸려들어 만들어진다. 임상적 의미는 별로 없다.가장 흔한 2 종류의 crystal-type casts는 calcium oxalates와 sulfonamides이며 uric acid crystals이 3번 째로 흔하다. 무정형 요산염(amorphous urates) cast가 보고되어 있다. crystal casts는 신세뇨관에 자극을 주어 출혈이 일어날 수 있으며 때로는 혈뇨와 동반되기도 한다.?B) 세포성 원주체(Cellular casts)?1) 적혈구 원주체(Red blood cell casts)cast 내에 적혈구가 존재한다. 거의 병적 상태로 간주하며 사구체 손상을 의미한다. 신사구체염, Wegener's granulomatosis등을 포함한 혈관염, 전신성 루푸스 등이 있을 때 적혈구 원주체를 동반할 수 있다. 또한 신장 경색, 아급성 세균성 심내막염 등도 적혈구 원주체를 보일 수 있다. 노랑색을 띤 갈색이며 원통형이다.?2) 백혈구 원주체(White blood cell casts)염증이나 감염을 의미하며 신우신염, 신장 감염 때 나타난다. 급성 알레르기성 간질성 신염, 신 증구군, 연쇄상 구균 감염 후 급성 신 사구체 염을 의심할 수 있다. 가끔 백혈구와 상피세포의 감별이 어려울 때도 있다. 이때는 특수 염색을 시도한다. 뭉친 백혈구 괴(덩어이)와의 감별은 hyaline matrix 존재 여부에 의한다. Hyaline mastric가 존재하면 원주체이며 없을 때는 WBC clump이다.?3) 세균성 원주체(Bacterial casts)신우많다.

의/약학| 2011.02.08| 9페이지| 1,500원| 조회(803)

생리학, 요침사, 소변, 소변검사, 원주체, 요침사현미경검사

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아프리카발톱개구리를 이용한 전기생리 연구

TITLE : 전기생리학전체개요1)Transformation (고체배지)2)LB broth (액체배지)3)miniprep : 증폭된 DNA가 삽입된 plasmid를 얻기 위한 과정4)DNA linearization : circular plasmid를 linear plasmid로 만드는 과정5)RNA transcription : RNA 합성단계6)Xenpus oocyte culture : 세포배양7)Nanoinjection : 합성된 RNA를 nano injector를 이용하여 개구리 알에 직접 주사8)Recording by two-electrode voltage clamp실습목적 : Xenopus lavis oocyte (아프리카 발톱 개구리) culture재료 : Xenopus lavis, needle holder, needle, 수술용 가위, 봉합실, 수술용 집게, ND 96 buffer, Ca2+ free buffer, collagenase방법 :1)개구리를 얼음 속에 20분 정도 묻어 마취를 시킨다.2)개구리가 움직이지 않을 정도로 되었을 때 배 쪽으로 뒤집어 피부를 절개한다.3)근육을 절개한다.4)알을 적출한다.5)collagenase를 30분정도 처리하는 동안 개구리를 봉합하여 준다.6)30분 후 현미경으로 알을 관찰한다.Check point-Xenopus lavis에 대하여양서류의 배 발생, 유도작용, 세포의 운명 및 패턴 형성 등에 대한 연구는 주로 무미 양서류인 Rana종류와 유미 양서류인 도롱뇽 등을 통하여 오래 전부터 수행되어 왔다. 한편 1980년대 이후부터는 세포의 행동과 유도작용의 메커니즘 및 유전자의 발현조절에 대한 지식이 폭발적으로 증가되었다. 이와 같은 지식의 급속한 팽창은 분자생물학적 기술의 발달과 더불어 분자적 분석에 적합한 실험 동물의 이용이 가능하기 때문인데, Xenopus도 그 중 하나이다.아프리카 원산 무미 양서류의 일종인 Xenopus laevis는 다른 양서류에 비해 실험 재료로서 몇 가지 장점을 지니고 있어 현재의 양서류 발생학 연구재료는 거의 Xenopus에 의존하고 있는 실정이다. 장점 중에는 난자(또는 수정란)을 계절과 무관하게 쉽게 구할 수 있고 실험실에서의 성체 사육이 가능하다는 점 외에도 발생 속도가 빠르고 외부의 충격에 대해서 잘 견딘다는 점을 들 수 있다. 따라서 유도작용의 메커니즘 및 유전자발현 조절과 같은 많은 분자유전학적 연구가 이 종을 이용하여 이루어졌다.우리나라의 개구리는 현재 안타깝게도 멸종의 위기를 맞고 있어 구하기가 쉽지 않으나 대신 황소개구리는 쉽게 구할 수 있다. 전세계적으로 Xenopus laevis라는 아프리카산 발톱 개구리를 실험실에서 많이 이용하고 있다. 이들은 닭이나 소 간 등을 먹기 때문에 실험실에서 사육이 쉽고, 알을 1년에 3회 이상 낳으므로 다른 양서류에 비해 실험재료로서 좋은 장점을 가지고 있다. 암컷은 수컷보다 크고, 수컷은 앞다리에 검은 육융(nuptial pads)을 가지고 있다.Xenopus laevis는 발생의 분자 생물학적 및 생화학적 실험을 접근을 위해 많이 사용하고 있다. 1930년대에 독일의 스페만은 등쪽에 형성체(organizer)라는 곳이 있어 이 지역을 복면 지역으로 이식하면 완전한 새로운 축을 형성하는 것을 관찰하였다. 이식된 조직들이 주변을 변화시켜 축 형성에 관여하도록 유도한 것이다. 이러한 현상을 유도작용(induction)이라고 한다. 양서류에서 큰 관심사 중의 하나는 어떻게 초기에는 없던 중배엽(mesoderm)이 포배시기에 유도되는가이다. 중배엽의 유도 또한 분자적으로 많은 연구가 진행되었다.Xenopus 알의 동물반구(animal hemisphere)는 검은 반면, 식물반구(vegetal hemisphere)는 난황이 있어 밝게 보인다. 개구리는 난할 방식이 전할(holoblastic)이며, 부등할의 특징을 갖는다. Xenopus의 첫 분열은 수정된지 약 100분 후에 일어나며, 경할 (vertical or meridional)로 일어나 접합자를 좌우 반으로 나눈다. 제2분열은 역시 vertical로 일어나나 첫 분열과는 직각으로 일어난다. 제3분열은 위할 (horizontal)로 적도면과 평행하게 일어나며, 약간 동물극쪽에 치우쳐서 일어나 동물반구세포가 식물반구세포보다 적다. 제3분열이 일어나면 동물반구에 4개의 세포, 식물반구에 4개의 세포가 있게 된다. 계속되는 난할로 모든 부위에 여러 세포층을 형성하는데 이러한 난할은 13번 분열까지 동시에 대칭적으로 일어난다. 포배(blastula) 말기는 포배강(blastocoel)과 몇 개의 작은 세포층으로 이루어진 두터운 포배강 덮개(roof)를 가지고 있다.포배가 끝나면 배(embryo)는 정자가 들어간 반대쪽에서 원구배순부(dorsal lip)을 형성하며, 이 곳에서 낭배(gastrulation)가 시작된다. 즉 세포가 이곳에서 안으로 함입해 들어간다. 낭배는 중배엽, 외배엽, 내배엽이 제자리를 찾아가 자리를 잡으며, 궁극적으로 각 배엽에 특징적인 기관들을 형성하게 된다. 낭배 시기 후에는 기관형성이 이루어지는데 처음으로 신경계가 형성된다 (neurulation). 신경계는 먼저 신경판(neural plate)이 형성되고, 곧 이어 신경습(neural fold)이, 그리고 신경관(neural tube)이 형성된다. 올챙이는 성체와는 달리 꼬리를 가지고 있는데 발생이 진행되면서 꼬리가 매우 빠른 속도로 퇴화되어 없어지는데 이를 변태(metamorphosis)라고 한다. 일종의 programmed cell death에 의해 사라진다

의/약학| 2011.02.08| 3페이지| 1,500원| 조회(394)

생리학, Xenopus laevis, 전기생리, 아프리카 발톱 개구리, Xeno..

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생화학 실험 레포트

1. Preparation of Tris-HCl buffer (0.05M, at the appropriate pH)실험내용1) Reagent and Materials0.1M Tris Base (Trizma), 0.1N HCl, 2L of distille water, pH meter, stirrer, magnetic bar, beakers, pipette, Kim wipe Balancer, spoons, paraffin papers.2) stock solutionsA: 0.1M Tris Base solution 500ml증류수 400ml를 0.5L비커에 넣는다.6.055g의 Tris-Base를 첨가한다.base를 완전히 녹인다. (using magnetic bar on the stirrer)B:0.1N Hydrochloric acid solution 500ml증류수 495.7ml를 0.5L비커에 넣는다.HCl 4.31ml를 첨가한다.3) Adjustment of the appropriate pH원하는 pH의 buffer를 만들기 위해 50ml의 Tris base solution에 0.1N HCl을 첨가한다. 이때 pH meter를 조심히 살피며 원하는 pH가 되었을 때 중단한다. 그리고 100ml를 만들기 위해 나머지는 증류수로 채운다.실험결과 및 고찰우리 조는 pH 7.5의 buffer를 만들었다. Tris base 50ml에 HCl이 40.6ml들어갔을 때 pH가 약 7.5 수준으로 나타났다.Buffer solution은 적은 양의 산이나 염기를 첨가하거나 희석시킬 경우 용액의 H+와 OH-의 농도 변화를 줄이기 위해 사용하는 용액이다. Buffer solutions은 약산과 그것의 짝염기로 이루어 진 것이 일반적이다. 용액의 pH변화에 저항하는 Buffer solutions의 원리는 Le Chatelier의 공통이온효과에 의해 설명될 수 있다.HA(aq) + H2O(l) → H3O+(aq) + A?(aq)만약 위의 용액에 염기를 첨가하면, 염기는 곧 산-염minator, mini centrifuger.2) 실험방법(1) E.coli (DH5)plasmid DNA를 분리한다.배양균체를 원심분리로 집균solⅠ ( Rnase, glucose, Tris-Cl, EDTA) 250ul 첨가하여 균체를 혼합한다.sol Ⅱ( NaOH, SDS- lysis beffer) 250ul 살며시 넣어서 위아래로 3~4회 부드럽게 섞어준다. 이때 주의해야 할 점은 세게 흔들면 chromosomal DNA가 분해되므로 세게 흔들지 않도록 한다.sol Ⅲ (acetic acid, potassium acetate- neutralization) 350ul을 넣어 3~4회 섞은 후 얼음 위에 5분동안 나둔다.원심분리 (10분 이상)spin column 에 원심분리 상등액을 조심스레 취하여 넣는다.30초 이상 spin down 한 다음 FT를 버린다.다시 washing buffer를 500ul 넣어 spin down 하여 FT를 버린다.약 10초간 spic down을 한 다음을 column을 새 1.5 tube에 얹고 ellution buffer를 50ul 넣어 1분 이상 둔다. spin down 하여 DNA를 얻는다.(2) agarose gel 확인1% agarose gel 로 앞에서 얻은 plasmid DNA를 1ul 올려 전기영동한다.조건 - 100V, 24min running, EtBr 염색 25분,1kbps marker size : pGEM-T Easy vector (의 사이즈)실험 결과 및 고찰왼쪽은 본인 시료의 lane이고 오른쪽은 marker 이다.왼쪽을 보면 두 개의 band를 관찰 할 수 있는데, 위쪽의 옅은 밴 드는 open circular plasmid DNA고 아래쪽의 짙은 밴드는 supercoiled plasmid DNA라 할 수 있다. 보통 DNA는 supercoiled form 으로 존재하지만 한 쪽 strand가 끊어져 supercoil이 풀어지게 되면 open circular form 이 된다. 그리고 superc는 비교적 renaturation이 잘 되지만, chromosomal DNA는 미처 renature되지 못하고 엉기게 된다. 이렇게 엉긴 chromosomal DNA를 원심분리로 제거하면 상층액에 plasmid DNA가 있게 된다.*실험에 사용되는 시약 및 용도(1)Solution I50 mM glucose25 mM Tris-Cl, pH 8.010 mM EDTAEDTA는 세포벽의 integrity를 유지하는 데 필수적인 calcium ion을 제거하여 세포벽이 군데군데 무너지게 한다. 이때 glucose는 삼투압을 유지시켜 세포의 외형을 유지시켜 둔다. 이 과정에서 실험상 vortex를 해야 하는데 이때 세포가 완전히 깨지게 되면 chromosomal DNA가 잘게 깨지게 되어 plasmid DNA와 구분할 수 없게 되므로 이렇게 세포를 유지시켜가면서 세포벽만 깨는 것이다.(2)Solution II0.2 N NaOH1% SDS (sodium dodecyl sulfate)SDS는 ionic detergent로 세포막을 깨는 역할을 한다. NaOH는 DNA를 denaturation시킨다. Chromosomal DNA가 잘게 부서지지 않게 조심스럽게 처리.(3)Solution III5 M potassium acetate, glacial acetic acidRenature시키는 산성용액. 이렇게 해서 Chromosomal DNA는 SDS와 potassium과 함께 엉기게 된다.3. BRADFORD 시약을 이용한 단백질 정량(1) 실험재료:시약- BRADFORD reagent (SIGMA), protein (BSA-농도를 아는 표준 단백질, E.coli cell extract- 측정용 단백질) PBS buffer: phosphate buffered saline장비 및 소모품: spectrophotometer, 1.5ml tubes, pipette, tips(2) 실험방법? E.coli cell extract 100ul, PBS buffer를 500ul 섞는다. (총 6.8. 한 시간 뒤, 시료가 들어있는 cornical tube를 꺼내서 e-tube에 1ml씩 넣고 원심분리 해 배지를 버린 뒤 균체만 남긴다. 네임펜으로 마킹한 후 발현을 멈추기 위해 얼음에 보관한다.9. 다시 한 시간 뒤에 와서 시료가 들어있는 cornical tube를 꺼내서 다른 e-tube에 1ml를 넣고 원심분리 해 배지를 버린 뒤 균체만 남긴 후 마킹 후 얼음이 담긴 통에 넣고, cornical tube는 다시 shaking incubator에 넣는다.-sonication(1)비커에 얼음을 가득 채운 후 본인이 속한 조의 시료를 모두 꺼낸다.(2)얼음속에 시료가 담긴 E-tube를 넣고 sonicator로 30amp에서 5초씩 sonication하고 10초 쉬는 식으로 8번 정도 한다.(3)E-tube를 6~8개 준비한다.(4)PBS 100ul를 각 시료에 넣고 위와 같은 방시긍로 sonication을 8번 정도 한다.(5)원심분리를 최고속도에서 2~3분동안 한다.(6)상층액만 취해서 새로 꺼낸 E-tube에 옮겨담고 시료이름/sup이라고 적는다.(7)남은 pellet에 PBS 100ul 위와 같은 방식으로 sonicationd 8번 정도 한다.(8)각 튜브에 ppt/시료명을 적는다.2) 실험결과 및 고찰이 실험은 SDS PAGE를 하기 위한 전 단계에 해당하는 실험이다. 원하는 단백질의 과발현을 유도하는 과정이다.E.coli (BL21)는 pREP4(kanamycin resistant)와 pQE9/DEH(amicillin resistant) plasmid를 가지고 있다. 여기에 lactose analog인 IPTG를 넣으면 DEH가 과 발현이 된다. 이때 shaking incubator에서 37도에서 배양한 후 샘플을 얻는다. 이때 처음 샘플에서 1ml를 튜브에 넣고, 1시간 뒤 1ml를 튜브에, 2시간 후 1ml를 튜브에 넣어서 시간에 따른 SDS-PAGE결과에서 밴드의 두께의 차이가 나는 곳이 DEH단백질이다.-주의할 점) 배지나 균체를 버릴자 할 때 IPTG를 넣어주어야만 충분한 양이 나오게 된다.-Sonicator (초음파 파쇄기)세포를 suspend buffer에 넣고 초음파를 이용해서 진동에 의해 세포를 파쇄한다. 이때 열이 발생하여 효소의 활성에 영향(세포 안의 protease가 활성화되어 단백질을 분해할 수 있다. 이러한 경우 smear한 상태로 나온다.) 을 줄 수 있으므로 반드시 아이스 상태에서 실험하도록 한다. 이 실험에서는 과발현된 단백질의 양을 측정하기 위해 세포벽 바깥으로 유출 시켜야 하므로 sonication을 한다. 이 때 버퍼의 성분과 초음파의 강도를 잘 조절하면, 막만 깨고 다른 내부의 단백질과 같은 내용물의 손상이 없는 상태로 파쇄물을 얻을 수 있다.또한 이 실험에서는 sup 부분에 가용성 단백질이 녹아 있게 된다. 그리고 ppt 부분에는 균체가 있는데, 불용성 단백질(folding이 잘못된)이 있을 수 있으므로 sonication으로 분쇄하여 이러한 단백질이 sup에 추출되도록 한다.5.SDS PAGE(sodium dodecyl sulfate poly acrylamide gel electrophoresis)-실험방법1) 4번 실험에서 얻은 각 시료들 (sup 5개, ppt 5개)을 열처리하고 runnig buffer, loading buffer를 넣어 염색한다. (양이 적은 경우 원심분리)2) 1~3ul를 피펫팅하여 polyacrylamide gel 의 well에 수직으로 시료를 넣는다.3) 1시간 동안 전기영동한다.4) COOMASSIE 로 염색 (10mim)5) 탈색 (20분간 3번) (탈색을 하는 이유는 단백질만 염색하기 위해서이고 많이 할수록 미세한 부분이 드러난다.)-polyacrylamide gel 만들기1) separating gel 만들기 (pH 8.8)코니칼 튜브에 밑의 시료들을 차례로 넣고 TEMED시료를 넣고 난 후 3~4번 섞은 후 붓는다. 그 다음 산소를 차단시킨 상태에서 굳게 하기 위해 n-부탄올을 붓는다. (다 굳은 후에 킴스와이프로 제거 된다.

자연과학| 2009.09.09| 11페이지| 2,000원| 조회(603)

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