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PCR, Electrophoresis, Purification, Restriction Enzyme, DNA ligation

1.PCR(Polymerase Chain Reaction)중합 효소 연쇄 반응(영어: Polymerase Chain Reaction, PCR)은 DNA의 원하는 부분을 복제·증폭시키는 분자생물학적인 기술이다. 이 기술은 사람의 게놈과 같은 매우 복잡하며 양이 지극히 미량인 DNA 용액에서 연구자가 원하는 특정 DNA 단편만을 선택적으로 증폭시킬 수 있다. 또한 증폭에 필요한 시간이 2시간 정도로 짧으며, 실험 과정이 단순하고, 전자동 기계로 증폭할 수 있기 때문에, PCR과 여기서 파생한 여러가지 기술은 분자생물학, 의료, 범죄 수사, 생물의 분류 등 DNA를 취급하는 작업 전반에서 지극히 중요한 역할을 담당하고 있다. 1984년에 캐리 멀리스(Kary Mullis)가 특정 DNA 서열을 증폭하기 위한 방법을 고안하여 중합 효소 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)이라고 불렀다. 1985년에 중합 효소를 클레나우 중합 효소(Klenow polymerase)로 사용하는 PCR이 처음 공식적으로 발표됐다. 클레나우 중합 효소는 열에 약했기 때문에 매 주기마다 효소를 새로 넣어 주어야 했고 생성물의 최대 길이는 400bp에 불과했다. 1988년에 DNA 중합 효소로 Thermophilus aquaticus라는 미생물의 DNA 중합 효소인 Taq를 사용한 논문이 발행되었다. 열에 강한 이 중합 효소는 PCR의 효율을 월등히 끌어올렸다. PCR에는 일련의 세 개의 단계가 있고 30~40회 정도 반복된다. PCR의 첫 번째 단계는 DNA를 변성(Denaturation)시키는 것이다. 두 가닥의 DNA는 가열함으로써 분리시킬 수 있다. 분리된 각각의 DNA는 주형(Template)으로서 역할을 하게 된다. 변성 온도는 DNA 내에 있는 G+C의 양과 길이에 따라 달라진다. PCR의 두 번째 단계는 결합(Annealing)이다. 이 단계에서는 시발체(Primer)들이 주형 DNA에 결합을 하게 된다. 결합(Annealing) 온도는 반응의 정확성을 결정tion)단계이다. 이 단계에서 열에 강한 DNA 중합 효소가 주형 DNA에서 새로운 DNA를 만들게 된다. PCR은 DNA, RNA 그리고 단백질 수준의 PCR로 나뉠 수 있다. 보통 유전자를 얻는 실험을 할 경우, 그 유전자의 전체를 보려는 것이 아닌 유전자 안에서의 특정 유전자를 관찰하는 것이 목적이다. 하지만 DNA를 바로 PCR하게 되면 특정 유전자를 얻기 힘들고 진핵 생물의 경우, 비발현부위(인트론; Intron)가 같이 나오는 등 여러 가지 문제점이 있다. 그것을 해결하기 위해 특정 유전자에 시발체를 붙인 다음, PCR을 DNA수준이 아닌 RNA나 단백질 수준에서 하는 역전사-PCR(RT(Reverse Transcriptase)-PCR)이 있다. 요즘에는 반응의 결과를 극대화하기 위해 Taq 중합효소 뿐만 아니라 여러 회사들에서 독자적으로 개발한 복합효소를 사용하기도 한다.1)PCR의 역사PCR법에 대한 발상은 1983년에 캐리 멀리스(K. Mullis)에게서 처음 나왔다. 그는 초창기 생명공학 회사였던 시터스(Cetus)의 연구원이었으며 우연찮게 PCR법을 고안해서 발표하게 된다. 처음 멀리스는 여러 저명한 과학 저널에 PCR법을 투고했으나 채택되지 않았고 실제로 논문은 1987년에 처음 게재된다. 시터스사는 중합효소의 종류를 바꾸는 등, 해당 기술을 개량하고 발전시켜 큰 성공을 거두게 되지만 이후 PCR 기술 자체가 뒤퐁(DuPont)사나 로체(Roche)사, 프로메가(Promega)사가 연관된 여러 특허 분쟁을 일으키게 된다. 현재는 1992년에 특허권을 획득한 제약 회사 로체사에 PCR법의 특허가 있다. 개발자 멀리스는 PCR법을 고안한 공로로 1993년 노벨 화학상을 수상한다. 현재는 PCR법도 더욱 다양한 응용 기술이 개발되었다. 이러한 응용 기술로는 역전사효소(reverse transcriptase)를 이용해서 RNA를 직접 증폭시키는 역전사-PCR이 대표적이며, 이외에도 형광 물질을 붙여서 PCR을 진행하며 관측되는 정량적인 변화를 를 단일가닥 DNA(ssDNA)로 분리시킨다. 높은 온도일수록 단일가닥 DNA 로 잘 이행되지만 Taq DNA 중합효소도 온도가 아주 높은 상태에서는 변성되어 사용하지 못하게 될 수 있으므로 보통 94°C로 한다. 첫 번째 주기(cycle)에서는 확실한 변성을 위하여 약 5분간 지속시킨다.(2) Primer Annealing50°C ~ 65°C에서 진행된다. 시발체(Primer)가 자신의 염기서열과 상보적인 염기서열을 갖고 있는 DNA에 결합하는 단계이다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어나므로 G-C 결합이 A-T결합보다 강하다. 따라서 G+C 비율에 따라 결합온도에 변화를 주는 것이 좋다. 사실 시발체를 만드는 것도 이 결합 온도(Annealing Temperature)를 고려하여 합성해야 한다. 일반적으로 G-C content 가 50%가 되는 primer 쌍을 이용하는 것이 바람직하다. 보통 30초가량 지속되는 이 단계에서 시발체의 5'→3'방향으로 DNA의 합성이 시작된다.(3) DNA Elongation70°C ~ 74°C에서 시행하며 원하는 PCR산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수도 있다. Taq 중합효소는 보통 1분에 2,000-4,000 염기쌍을 중합할 수 있으므로 원하는 PCR산물의 크기 1kb마다 1분 정도의 시간을 배당하면 충분히 반응이 일어난다. 마지막 cycle에는 약 10분 정도 시간을 충분히 주는 것이 좋다.이 과정이 계속 반복하여 진행되면서(보통 25∼35회) DNA의 원하는 부분을 증폭시키는 것이 PCR 의 원리이다.3) PCR의 구성요소(a) PrimerPCR의 가장 중요한 요소이며, 그것의 정확도를 결정한다. Primer의 길이는 너무 길어도 안되며 너무 짤아도 안된다. 너무 짧다면, 인간의 genome처럼 많은 양의 nucleotide로 구성 된 DNA molecule을 대상으로 하면 primer가 인식할 수 있는 site가 rase는 Taq1 polymerase로 이것은 Themus aquaticus로 부터 추출한 효소이다. 이 생명체는 바다 밑의 뜨거운 곳에서 사는데, 이 때문에 대부분의 효소가 열에 저항성이 있다. 따라서 Taq1 polymerase 역시 열에 대단히 resistent하다. 그리고 이러한 성질이 PCR에서 이 polymerase를 쓰는 이유가 된다. 보통 PCR을 할 경우, denaturation 과정에서 온도가 94℃까지 올라가며, 대부분의 단백질은 이 온도에서 변성이 되어 그 기능을 상실한다. 하지만 Taq1 polymerase는 열에 대단히 resistent하기 때문에 이 온도에서도 변성이 되지 않고, 이 때문에 PCR에서는 이 효소를 사용한다. 일반적으로 eukarytoe에 DNA polymerase의 경우에는 proof-reading기능이 있으나 Taq1의 경우에는 그 기능을 가지고 있지 않다. 따라서 error rate가 매우 높다. (1/9000) 이 수치가 어떻게 보면 아무렇지도 않다고 여길 수도 있겠지만, PCR에서는 전과정에서 만들어진 copy가 다음 과정에서의 template가 되므로 한번 error가 발생하면 그것을 template로 사용한 모든 copy가 다 error를 가지게 된다. 따라서 약 30번 정도 반복하면 error rate가 1/300 bp로 증가하게 되며 이 수치는 결코 무시하지 못한다4) PCR법의 이용PCR법은 현재 생물학에서 쓰이지 않는 곳이 없다고 해도 과언이 아닐 정도로 광범위하게 사용되는 기술이다. 또한 근래 과학 수사나 친자 감별 등에 자주 이용되는 DNA 지문 분석(DNA fingerprinting) 역시 PCR법을 이용해서 이루어진다. 생물학에서는 여러 유전병을 판별하기 위해서 인간 유전학에서 사용하는 경우가 있으며, 오래된 고생물이나 멸종 생물의 희소 DNA를 증폭하기 위해서도 이용된다. 분류학에서도 종 간의 DNA 비교를 위해 PCR법을 널리 이용하고 있으며, 분자생물학에서는 DNA나 RNA를 다루기 위q을 사용할 때 DNA 합성의 최적온도 는 대개 70~80℃ 이 고 그 합성속도는 60nucleotides 이상/초이다. 활성 반감기는 92.5℃에서 130분 이상, 95℃에서 약 40분, 97.5℃에서 약 10분간이다.(2) Mg2+ 농도일반적으로 PCR반응에서는 1.5~2.5 mM의 Mg2+ 농도가 필요하다. Mg2+ 농도는 PCR을 실행할 때 다음의 사항에 관여하고 있는 것으로 여겨진다. ① 효소활성, ②primer의 annealing, ③ 합성된 DNA의 충실성, ④primer-dimer의 형성 등이다. 킬레이트제(예를 들면 EDTA)는 반응액 속의 Mg2+ 농도에 영향을 미치므로 주형으로 사용하는 DNA 용액에서 turn over하는 것에 주의할 필요가 있다. 또한 유효한 Mg2+ 농도는 dNTP 농도와도 관계가 있으므로 어느 실험에서나 최적 Mg2+ 농도를 결정하고자 할 경우 항상 dNTP 농도를 고려해야 한다. 일반적으로 Mg2+ 농도가 높아지면 DNA 합성의 정확도에 영향을 미칠뿐만 아니라 두가닥 DNA 변성이 어려워지고, Taq polymerase는 10 mM MgCl2에 의해 40~50%의 저해를 받으므로 MgCl2를 과잉 첨가하는 것은 바람직하지않다.(3) dNTPPCR의 효율, 특이성면에서 보면 20~200 μM에서 양호한결과를 얻을 수 있다. DNA polymerase가 잘못된 dNTP를 사용하는 mismatch 현상은 dNTP 농도에 강하게 의존한다. dNTP 농도를 낮추는 쪽이 PCR 특이성과 정확도가 높아지므로 dNTP 농도를 낮추면 misprimming이 감소하여 PCR의 정확도가 높아진다. 단 사용하는 Mg2+ 농도에 따라 dNTP의 최적농도가 달라지므로 주의가 필요하다.(4) 반응첨가물많은 염기배열에 복수의 primer set를 사용하여 동시에 1개의 반응 tube 내에서 PCR 증폭하는 방법을 다중 PCR(multiplex PCR)이라 한다. 근육병의 원인인 디스트로핀 유전자의 결실변이를 18종류의 primer를 사용하여 검SDS(

자연과학| 2010.05.24| 22페이지| 2,000원| 조회(479)

유전공학, 생명공학, PCR, 생물학, 분자생물학, restriction enzy..

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지구온난화 평가C아쉬워요

지구온난화그 원인과 대책 200813175 생명과학부 서민호1. 지구온난화란?지구의 표면 온도가 상승하는 현상. CO2및 NH4는 빛과 열을 방출하지 않음. 온실효과. 본래 지구의 온도를 일정하게 유지하므로 지구생태계가 생명을 유지할 수 있도록 하는 중요한 기능 온실효과가 필요 이상으로 적용 된 것 해수면이 높아져서 발생하는 사건 등을 포함한 광범위한 현상을 통칭2.지구온난화의 원인?가.이산화탄소 -과거 식물의 광합성과 동식물의 호흡 비율이 일정 -인간활동의 영향으로 CO2 발생량 상대적으로 많아짐 -주로 탄소성분(석유,석탄)에 의한 공업 에서발생.나. 프레온가스-일반적으로 프레온가스는 오존층 파괴에 영향을 준다 -오존층이 파괴되면 자외선 영역대의 지구 복사에너지를 가중시켜서 지구의 평균 온도를 상승시키는 역할을 한다.- 증가된 자외선은 식물과 산림을 파괴하여 식생에 의한 CO2 의 사용량을 감소시키게 되며 이는 결과적으로 CO2의 농도를 높게 유지시키는데 한 몫을 한다.다. 메탄-메탄 증가의 주된 원인은 가축의 증가 -전세계의 60%이상의 목초지가 파괴 -목초지의 파괴로 인해 1차적인 지구온난화 유발.-햄버거 1개에 들어가는 쇠고기를 위해 2.5평의 땅이 소모 -매년 13억 마리의 가축들이 6천만 톤의 메탄가스를 방출3. 지구온난화의 실태매년 꾸준히 큰 폭으로 증가. 들쭉날쭉 한 것은 계절의 변화. 앞 자료의 이산화탄소 증가율과 비슷한 곡선을 나타냄.4.지구온난화의 피해가. 농업 -1m의 수위상승으로 이집트 에서는 인구의 16%, 국내총생산의 15% 감소 예상. -등온선이 북상함으로 인해 모든 지역의 재배조건 변경됨. 농업관계자들의 우량, 우기, 건기에 대한 부족한 정보나. 육상생태계 -35년 후 평균기온1'C 상승시 현재의 식생 80km 북방 이동. -그러나 식물의 이동 능력은 연 평균 10~100m (35년 후 약 2km) -기후조건을 따라가지 못하고 생태계 붕괴 예측.다. 인간 -온난화에 의해 토지 면적이 줄어듦. 인구밀도 상승하여 거주에 영향을 미친다. 또한 태풍, 허리케인, 사이클론 등의 강도 증가 예측5. 지구온난화에 대한 대책가. 몬트리올 의정서 -오존층 파괴물질의 생산 및 사용의 규제 -염화불화탄소의 단계적 감축, 비가입국에 대한 통상제재 -한국은 1992년에 가입하였다.나. 교토 의정서-의무이행 대상국은 오스트레일리아, 캐나다, 미국, 일본, 유럽연합(EU) 회원국 등 총 38개국이며 각국은 2008∼2012년 사이에 온실가스 총 배출량을 1990년 수준보다 평균 5.2% 감축하여야 한다. -감축 대상 가스는 이산화탄소(CO₂), 메탄(CH₄), 아산화질소(N₂O), 불화탄소(PFC), 수소화불화탄소(HFC), 불화유황(SF6) 등의 여섯 가지이다. -미국은 전세계 이산화탄소 배출량의 28%를 차지하고 있지만, 자국의 산업보호를 위해 2001년 3월 탈퇴하였다.다.기후변화협약-목적은 이산화탄소를 비롯한 온실가스의 방출을 제한하여 지구온난화를 방지하고자 하는 데에 있다. -규제대상 물질은 탄산·메탄가스·프레온가스 등이 대표적 예이다. -염화불화탄소(CFC)를 제외한 모든 온실가스의 배출량과 제거량을 조사하여 이를 협상위원회에 보고해야 하며 기후변화 방지를 위한 국가계획도 작성해야 한다.아름다운 지구를 위하여 세계인 모두가 노력하여야 합니다.-끝-{nameOfApplication=Show}

자연과학| 2009.09.23| 11페이지| 1,500원| 조회(446)

지구온난화, 지구온난화 영향, 지구온난화대책

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