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RNA 추출 실험 결과 레포트

TRI REAGENT (RNA REAGENT) - PNA prep.1. TRI REAGENT 1ml/50~100mg tissue를 넣고 homogenization한다.→ TRI TEAGENT - phenol : DNA 단백질 분리, 단백질을 녹임.- GuSCN : Guandininie thio cyanate 단백질을 변성시킴.? RNase 기능을 못하게 함.2. nucleoprotein complexes를 분리하도록 5분 동안 실온에 둔다.3. TRI REAGENT 1ml당 0.2ml의 chloroform을 넣고 15초 동안 세게 흔든다.4. 용액을 잘 섞고 실온에서 2~15분 동안 반응한다.5. 4℃, 13000rpm에서 10분간 원심분리 한다.6. 상층액을 분리하여 새로운 tube에 옮긴다.→ 제일 조심해야 한다. 체액이 들어가면 RNA가 분리된다.7. TRI REAGENT 1ml당 0.5ml의 isopropanol(=isopropyl alcohol)을 넣고 10분간반응한다.8. 4℃, 13000rpm에서 10분간 원심분리 후 pellet을 얻는다.9. 1ml의 75% ethanol을 넣고 4℃ 12000rpm에서 5분간 원심분리 한다.10. Ethanol 제거 후 3~5분간 air-dry 한다. (이때 완전히 dry 하면 안 된다.)→ 그냥 실온에서 놔두어 말린다. vecum을 사용하지 않는다.너무 dry하면 녹이기 힘들다.11. DEPC 처리된 d.d water에 녹이고, 당을 제거하기 위해 55~60℃에서 10분간heating 한다. (혹시 남아 있을지 모르는 RNase 기능을 억제 한다.)→ DEPC : Ditethl Pyrocarbonate, RNase inhibiter로서 RNase 기능을 억제 한다.-실험결과콩 조직 RNA 추출 및 전기영동- 1.2% TBE agarose gelRNA 추출 시 사용한 조직은 식물의 뿌리혹과 뿌리를 사용하였다. 원래는 뿌리혹만 모아서 하려 했으나 식물의 뿌리혹의 양도 적고 너무 작아 조직을 때내는 데만 시간이 너무 걸려서 뿌리혹과 뿌리를 같이 했다. 진희는 뿌리혹이 없는 뿌리로 하였다.식물에서 추출한 RNA 레인 경우 5~4개 정도의 band가 나와야 한다. 중간 부분에는 rRNA로서 양이 제일 많아 band가 2개나 나타난다. mRNA는 종류가 다양하지만 양은 적기 때문에 약하게 희미하게 보인다. tRNA는 가장 무거워 맨 아래 나타나는 band이다. 그리고 식물 조직에서는 이 RNA들을 제외한 2개의 band가 더 나타나는 데 이 band들은 RuBISCO로서 Large subunit과 Small subunit으로 위아래에 나타난다.만약 tRNA만 나온다면 그건 tRNA만 추출 되거나 양이 많아서가 아니라 모든 RNA가 부서져서 생긴 것이다. 꼭 rRNA가 나와야 성공했다고 볼 수 있다.그러나 내 결과를 보면 눈에 확실히 보이는 band는 3개정도 밖에 안 되는 것 같다. 그러나 자세히 보면 5개 정도의 밴드가 나온다.2개의 rRNA와 2개의 RuBISCO 희미한 mRNA band들 그리고 맨 아래의 tRNA까지 정확하게 band 구분은 안 되지만 생각보다 band가 잘 나온 것 같다.만약 이 band들이 정확한 것이 아니면 아래에 불룩할 정도로 많은 tRNA로 추측되는 band가 RNA들이 부서져서 나온 것이라고 할 수 있다.이번 실험에서 RNase control이 가장 중요한 관건이었다. 체액과 액포에는 RNase가 들어 있어 RNA가 분해되어 RNA 추출에 어려움이 생길 수 있다. 실험을 진행 하는 모든 과정에서 RNase를 조심하였다. 조직을 갈 때에도 액포가 터지지 않게 액체 질소를 넣어 가면 갈았고, 모든 과정에 체액이나 각질 등 몸에 있는 것들이 들어가지 않게 조심했어야 했다.또 이번 실험에서는 대부분 강한 화합물을 사용함으로 특별히 주의를 기울여야 했다.이번 전기영동 시 TAE buffer를 사용하지 않고 TBE buffer을 사용하였다. 그 이유는 RNA 전기영동 시 긴 RNA가 hairpin 구조를 형성하여 짧은 것과 크기가 구분 되지 않고 아래로 내려 갈 수 있기 때문에 hairpin 구조 형성을 방지하기 위해 전기영동을 100V에서 실시해 hairpin 구조를 만들 시간을 주지 않고 전기영동을 빨리 하였다. 그러나 100V 전기 영동 시 TAE buffer를 사용하면 100V를 이기지 못하기 때문에 TAE buffer 보다 강한 TBE buffer를 사용하였다. 그리고 이때 대부분 Methyl mercury & Fofmaldehyde gel을 사용하는데 우리 실험에서는 그냥 일반 Agarose gel을 사용하였다.

자연과학| 2010.05.08| 3페이지| 1,500원| 조회(1,402)

실험 방법, 유전공학 실험, RNA 추출, 실험 결과, RNA 추출 실험 결과

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Mini-preparation of plasmid DNA 추출

Mini-preparation of plasmid DNA 추출1. O/N시킨 bacteria 3㎖를 eppi-tube에 넣어주고, 30초 동안 centrifuge 한다.▷ 더 많은 DNA를 추출하기 위해 2번 반복했다.2. 240㎕ TEG용액(solution 1)을 넣고 vortexing하여 섞어준다.▷ 최강으로 vortexing해 준다.3. 480㎕ NaOH/SDS(0.2M/1% : solution 2)를 더하고 tube를 뒤집기를 반복하여 부드럽게 잘 섞어준다.▷ NaOH/SDS은 세포벽에 구명을 만들어줘서 plasmid가 나오는 통로를 만들어 준다.▷ 최고 약하게 섞어주는 이유는 cell wall이 느슨해져 있어 세포가 터질 수 있기 때문 이다.4. 360㎕ KOAc(3M : solution 3)를 넣고 tube를 거꾸로 하여 vortexing 한다.▷ tube를 거꾸로 하고 vortexing하는 것은 약간 부드럽게 섞어주는 방법이다.5. 얼음에 5분간 둔다.6. centrifugation(10분/4℃)한 후, 윗 용액에서 900㎕를 새로운 tube로 옮긴다.7. 540㎕ propanol(4℃)을 넣고 centrifugation(15분/4℃)한다.8. 얻어진 pellet에 500㎕ EtOH(70%)를 넣고 vortexing하여 씻어준 후, 다시 centrifugation (15분/4℃)한다.9. 얻어진 pellet을 vacum dry(약10초)한 후, 50㎕ TE에 용해시킨다.▷ 이때 DNA가 투명한 색이 아니라 흰 색이 나온다. 그러나 젖어 있으면 투명하다.10. Plasmid DNA 50㎕를 제한효소(EcoR 1)로 처리한다. 이때 대조구도 함께 만든다.▶ 제한효소 EcoR 1① 10×buffer 3㎕② d.d water 6.5㎕③ DNA 20㎕④ EcoR 1 enzyme 0.5㎕⑤반응이 끝난 후, 10×loading buffer 1㎕ 넣어준다.cf) EcoR 1을 마지막에 넣어주는 이유는 손의 온도(37℃) 때문에 활성화 될 수 있기 때문에 제일 마지막에 넣어준다.▶ 대조구① d.d water 6㎕② DNA 3㎕③ 10× loading buffer 1- 실험결과1,. plasmid DNA 추출 결과< pig의 plasmid DNA 추출 결과 >U : uncut(restriction enzyme 처리 안한 plasmid DNA)C : cut(restriction enzyme 처리 한 plasmid DNA)U : uncut(restriction enzyme 처리 안한 plasmid DNA)C : cut(restriction enzyme 처리 한 plasmid DNA)* 결론 : 아래 넓게 퍼진 것은 RNA로 RNase 처리 유무로 인해 알 수 있다. band처럼 또렷하게 안 보이고 아래쪽에 끌림 현상이 있는 것은 양이 너무 많거나 상등액을 뽑아낼 때 불순물이 섞여서 그렇다. uncut한 것에서는 원래 T-vector의 크기 3015bp에 우리가 삽입한 pig actin insert DNA의 크기 850bp를 더한 3865bp가 나와야 한다. 그리고 cut한 것에서는 868bp와 2997bp의 크기를 가진 DNA가 나와야 한다.1조의 결과를 보면 uncut한 것은 3865bp에 크기를 가진 DNA가 band로 제대로 나왔는데, cut한 것을 보면 4000bp에서 band를 관찰할 수 있다. 이것을 보면 plasmid DNA가 제대로 잘리지 않은 것을 알 수 있다. 효소가 처리될 때 제대로 반응이 되지 않은 것으로 추측한다.pig의 plasmid DNA 추출 결과 가장 잘 나온 것이 5조이다. 5조의 band를 보면, 제한효소를 처리하지 않은 것에서는 3865bp에서 band가 보이고 제한효소를 처리한 것에서는 868bp와 2997bp에 band가 나온 것을 볼 수 있다.< Plant의 plasmid DNA 추출 결과 >U : uncut(restriction enzyme 처리 안한 plasmid DNA)C : cut(restriction enzyme 처리 한 plasmid DNA)U : uncut(restriction enzyme 처리 안한 plasmid DNA)C : cut(restriction enzyme 처리 한 plasmid DNA)* 결론 : 노란 화살표 표시는 제한효소에 의해 잘리는 단편이 작아서 RNA와 겹쳐 잘 안보여 표시하였다. 제한효소를 처리하지 않은 plasmid DNA에서는 T-vector의 크기인 3015bp에다가 우리가 삽입해 준 plant actin insert DNA의 크기 320bp를 더한 3335bp가 나와야 한다. 그리고 cut해 준 것에서는 두 부분이 끊어져 338bp와 2997bp 크기를 가진 band를 볼 수 있어야 한다.1, 2, 5조에서 결과가 가장 잘 나왔다.< RNase 처리, 무처리, 처리 후 EcoR 1 처리 결과 >1 : RNase 무처리2 : PNase 처리3 : RNase 처리 후 EcoR 1 처리(흐리지만 300bp와 400bp 사이에 band가 존재함)-아래 진하고 넓게 퍼진 것은 RNA.( RNase 처리 유무로 인해 알 수 있음.)-Plant 의 경우 제한효소에 의해 잘리는 단편이 작아서 RNA 와 겹쳐 잘 안보여 표시를 한 것임.- band처럼 또렷하게 안보이고 끌림 현상이 있는 것은 양이 너무 많거나 상등액을 취할 때 불순물이 섞인 것으로 보임.- 제한효소가 처리된 band 는 아래와 같은 단편이 나와야 DNA 가 삽입된 것

자연과학| 2010.05.07| 5페이지| 1,500원| 조회(619)

실험결과, DNA 추출, 실험 방법, 유전공학 실험, plasmid DNA ..

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PCR 결과 레포트

PCR (Ploymerase chain reaction)1. PCR로 증폭할 DNA에 actin gene 부분을 잘라낸다.① d.d water 7㎕② Actin primer 5' 1㎕Actin primer 3' 1㎕③ Pig DNA 1㎕ (or plant DNA 1㎕)④ 2× i - Max (Tag polymerase, dNTP) 10㎕= total. 20㎕2. 만든 용액을 원심 분리한다.3. PCR을 30번 돌린다.① 95℃, 2min② denture to separate template strands (95℃, 30 sec) : Denature DNA (변성)③ anneal primer to single strand template (55℃, 30 sec) : Anneal Primers④ polymerase synthesis new DNA strand to made double strand (72℃, 1 min): Extend Primers (DNA 합성)⑤ 72℃, 5min⑥ 쉬는 time (16℃)⑦ go to 2) - 4) (30 times)* 원리① DNA의 변성 (denaturation) : 94℃ ~ 96℃로 가열하여 이중가닥 DNA를 단일가닥 DNA로 분리시킨다.② Primer의 결합 (annealing) : 50℃ ~ 65℃에서 진행된다. 염기간의 결합은 G와 C는 세 군데에서 수소결합이 일어나고, A와 T는 두 군데에서 결합이 일어난다.③ DNA의 합성 (polymerization) : 70℃ ~ 74℃에서 시행하여 DNA 합성이 일어난다. 원하는 PCR 산물의 크기가 크거나 반응요소의 농도가 낮을 때에는 시간을 연장시킬 수 도 있다.▷ PCR에 넣은 DNA는 2n으로 증폭된다.4. 전기영동을 하기 위해 준비되어진 agarose gel 판의 well에 만들어진 20㎕ 용액을 조심 스럽게 loading 한 후 전기영동하고 band를 관찰한다.Gene clean (gel elution)1. 전기영동 한 gel을 UV등에 올려놓고 band 부분만 깨끗이 자른 후 eppi-tube에 넣는다.(gel의 무게 300mg정도, UV 노출 시간은 최대한 짧게)2. 500㎕의 DE buffer를 넣고 잘 섞어준다.3. 55℃에서 10분 동안 incubate하며 2~3분마다 섞어준다.4. Gel이 용액에 완전히 녹은 걸 확인한다.5. collection tube에 넣고 30초간 centrifuge(실온에서 13,000rpm)6. 걸러진 용액은 버리고 600㎕의 wash buffer를 넣는다.7. 30초간 centrifuge(실온에서 13,000rpm) 한다.8. 걸러진 용액을 버리고 column matrix를 말리기 위해서 3분간 centrifuge(실온에서 13,000rpm) 한다.9. 말려진 column을 새로운 eppi-tube에 옮긴다.10. 20㎕의 elution buffer를 넣고 matrix에 흡수될 때까지 2분간 실온에 둔다.11. 2분간 centrifuge(실온에서 13,000rpm) 한다.cf) Pig DNA로 실험한 결과가 5조를 제외하고는 DNA가 나오지 않아서 5조만 실험하여 PCR로 증폭해서 2㎕씩 나누어 실험하였다.PCR Product Cloning(T-vector)1. Agarose gel에서 gene cleaning 법으로 DNA를 회수한다.▷ DNA를 확인하는 과정에서 UV 노출시간을 최대한 짧게 한다.2. 다음 용액을 순서대로 넣고 섞는다.① d.d water 1㎕② 2× Rapid ligation buffer 5㎕③ PCR product 2㎕④ T4 DNA Ligase 1㎕⑤ pGEM - T Easy vector(50ng) 1㎕= total. 10㎕→ DNA : vector = 3 : 13. 잘 섞은 다음 4℃에서 O/N 반응 시킨다. (또는 15℃에서 3시간 반응)4. JM 109를 접종하여 밤새 키운다.E. coli Transformation* Competent cell 만들기1. 10㎖ LB에 JM109(for pGEM or pUC series)을 37℃에서 밤새 키운다.2. 다음날 새로운 LB 10㎖에 밤새 자란 대장균을 100㎕ 옮겨 넣고 37℃에서 2시간 자라게 한다. (정상적으로 자란 경우 흔들어 줄 때에 bacteria의 움직임을 감지 할 수 있다. 그렇 지 않을 경우는 조금 더 자라게 둔다.)▷ 새로운 LB 10㎖(10,000㎕)에 대장균 100㎕ 옮겨 넣는 것은 1/100만큼 희석 시 키는 것이다.▷ 37℃에서 밤새 키운 대장균을 다음날 1/100로 희석시켜 다시 2시간 자라게 하 는 것은 성장 중인 bacteria를 사용하기 위해서 이다. (밤새 키운 bacteria는 사멸기로 가는 중인 것이고 다시 2시간 자라게 한 bacteria는 대수 증식기에 있는 활력이 강한 것이다.)3. centrifuge (4℃에 8,000 rpm에서 8분)한 후 얻어진 bacteria를 차가운(4℃)0.1M MgCl₂ 10㎖에 잘 섞어 준다.▷ Mg?²은 cell wall을 느슨하게 해준다.4. centrifuge(위와 같은 조건)한 후 얻어진 bacteria를 차가운 0.1M CaCl₂ 5㎖에 잘 섞어 준다.▷ Ca?²은 cell wall을 느슨하게 해준다.▷ 원심분리 할 때 잘 된 competent cell은 tube 바닥에 원모양을 그린다.5. 얼음에 tube를 20분간 둔다.6. centrifuge(위와 같은 조건)한 후 0.5㎖의 0.1M CaCl₂에 잘 섞어준다.7. 100㎕씩 나누어 만들어진 competent cell을 eppi-tube에 보관한다. (4℃에서 2일 정도)*Transformation8. 100㎕의 competent cell에 8㎍(ligated)의 DNA를 넣고 얼음에서 30분간 둔다.9. 42℃에서 2분간 heat shock을 주고 얼음 위에서 2분간 식혀준다.▷ DNA가 세포 안으로 들어간다.10. 2× volume의 LB를 넣어주고 37℃에서 40분간 tube를 흔들어 자라게 한다.▷ 2× volume 200㎕11. 총 308㎕를 centrifuge(13,000rpm에서 1분)한다.12. centrifuge하여 나눠진 위층 200㎕를 버린다.▷ 200㎕를 버리는 이유는 대장균을 배지에 깔 때 더 많은 양을 깔기 위해서 이다.13. 100㎕를 LB plate(경우에 따라 antibiotic을 포함한)에 spread한 후 37℃에서 밤새 자라게 한다.cf) 모든 용액과 조작은 무균상태를 유지 하여야 한다.Positive control & Negative control* Positive control1. LB배지에 AMP를 깐다.2. 완전한 plasmid를 넣은 competent cell을 그 위에 깐다.▷ 실험 순서와 방법은 위에 형질전환 실험을 한 것과 동일해야 한다.① 실험 목적: 완전한 plasmid에는 AMP 저항성 유전자가 있기 때문에 colony가 나와야 된다. colony가 나오지 않은 경우에는 competent cell에 문제가 있다는 것을 알 수 있다.② 실험 결과: colony가 나오지 않았다. competent cell에 문제가 있다는 것을 알 수 있 다. 그래서 새로운 competent cell을 가지고 실험을 했다.③ 재실험 결과:spreading한 박테리아 양colony 수positive(T-fljB 200ng 사용)100㎕2000개200㎕6176개T-pig actin100㎕2개200㎕8개T-plant(강아지풀) actin100㎕32개200㎕95개④ 형질전환 효율: 2544(100㎕의 평균) × 3 cfu/200ng = 7632 × 5 cfu/5ng= 38160 cfu/㎍= 3.8 × 10⁴ cfu/㎍* Negative control1. LB배지에 AMP를 깐다.2. T-vector가 없는 competent cell을 그 위에 깐다.▷ 실험 순서와 방법은 위에 형질전환 실험을 한 것과 동일해야 한다.① 실험 목적: 순수하게 competent cell를 배지 위에 깐 것으로 AMP 저항 유전자가 없기 때문에 AMP로 인해 모든 competent cell이 죽어서 colony가 발생하지 않는다. 만약 colony가 나왔다면 AMP가 잘못 된 것이거나 외부로부터 오염된 것이라고 추측할 수 있 다.② 실험 결과: colony가 나오지 않았다.-실험결과1) Genomic DNA PCR 결과Pig genomic DNA PCR 결과< 당근 actin primer 사용 >* 결론 : 850bp에서 band가 보이는 5조가 가장 잘 나왔고, 다른 조도 흐리지만 band가 보인다. 5조보다 흐리게 나온 이유는 PCR을 돌릴 DNA의 양이 적었던 것으로 추측할 수 있다. 그리고 대체적으로 흐리게 나왔는데, 이것은 동물 조직에 당근actin primer를 사용해서 동물이 식물보다 DNA 복제가 잘 안 되었다고 생각할 수 있다.Plant genomic DNA PCR 결과< 당근 actin primer 사용 >* 결론 : 식물 DNA는 3조의 DNA로 다 같이 사용하였다. 모든 조가 300bp에서 band가 진하고 불룩하게 생겼다. PCR 30 cycle 돌릴 때 DNA가 엄청나게 증폭되었음을 알 수 있다.2) Actin 유전자 colony 수Pig actin 유전자 colony 수Pig actin 유전자 colony 수1조1개2조없음3조없음4조없음5조없음6조없음7조없음* 결론 : 1조를 제외하고는 다른 조에서 colony가 발견되지 않았다. 하지만 1조에서 나온 colony 수도 1개여서 오염됐을 가능성이 높다. Positive control을 실험한 결과, colony가 나오지 않아 competent cell이 잘못 된 것을 알 수 있으므로 colony가 나오지 않은 것으로 알 수 있다.

자연과학| 2010.05.07| 8페이지| 1,500원| 조회(1,464)

PCR, 유전공학 실험, 실험 결과, PCR 실험 방법

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