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병원미생물학실험_report_6_(Catalase 와 Protease 효소 확인)

병원 미생물학 실험 결과report1. SubjectCatalase 와 Protease 효소 확인2. Object실험 시 이용되는 균주가 Catalase 와 Protease 활성을 나타내는 가를 확인해보고, 이 두 가지 효소에 대해서 이해한다.3. Principle1. Catalase란?Catalase는 과산화수소(hdrogen peroxide)를 H2O와 O2(bubbles)로 분해하는 효소이다. 과산화수소는 호흡에 의한 산물로서 cell에 축적 시 cell이 죽게 되는데, Catalase는 cell에 damage를 주기 전에 cell 내에 있는 과산화수소를 분해하는 효소이다.2H2O2 → 2H2O + O2과산화수소에 이산화망가니즈를 넣으면 빠르게 기포가 발생한다. 그 이유는 위의 반응식대로 반응이 진행되기 떄문이다. 과산화수소는 이산화망가니즈 없이도 물과 산소로 분해될 수 있지만, 이산화망가니즈는 반응이 일어나는 속도를 빠르게 해 주는 물질이다. 즉, 어떠한 반응을 촉진시키는 물질인 촉매인 것이다. 우리 몸 속에도 이산화망가니즈와 비슷한 역할을 하는 촉매가 있는데, 이것이 바로 카탈라아제이다.생체 내에서 일어나는 반응을 촉매 하는 단백질을 효소라고 하는데, 카탈라아제 역시 효소의 일종이다. 과산화수소와 같은 과산화물은 세포막에 나쁜 영향을 끼치기도 하고 효소와 같이 몸 속에서 중요한 기능을 하고 있는 물질들을 방해하기도 한다. 따라서 몸 속에 과산화수소가 존재하면 이를 빨리 파괴시켜 주어야 하는데, 카탈라아제가 이 역할을 한다. 즉, 과산화수소가 물과 산소로 분해되는 반응이 빨리 일어나도록 도와주는 것이다. 카탈라아제는 간 속에 많이 존재하는데, 우리가 간의 주요기능으로 해독작용을 이야기하는 것은 바로 카탈라아제와 같이 몸에 해로운 물질을 빠르게 없애 주는 효소들이 간에 많이 들어 있기 때문이다. 카탈라아제는 우리 몸 속 의 간 뿐 아니라 적혈구나 신장에도 들어 있다. 과산화수소는 세균을 소독하는 작용도 하기 때문에 몸에 작은 상처가 났을 때 흔하게 쓰인다se를 pseudocatalase라 한다. 전형적인 catalase 효소는 과산화수소를 가수분해하고 산에 강하나 pseudocatalase는 산에 약하다. Catalase는 대부분의 cytochrome을 함유한 호기성 및 통성 혐기성 세균에 존재하지만 연쇄구균을 포함한 일부 균종에는 없다. Catalase 효소는 Hydrogen peroxide를 가수분해하여 물과 산소를 만들며 cytochrome system이 없는 세균의 대부분은 catalase 효소가 없으므로 과산화수소를 가수분해하지 못한다.3) 대부분의 혐기성 세균은 catalase 대신에 peroxidase 효소를 가지고 있으므로 혐기성 세균에서의 catalase 시험은 peroxidase에 의해 간섭 영향을 받을 수 있기 때문에 비특이적인 시험방법이다.나. 이용1) 균속 또는 과의 감별 분류가) Streptococci (-), Micrococcus/Staphylococcus (+)나) Bacillus (+), Clostridium (-)다) Listeria monocytogenes/Corynebacterium (+), Erysipelothrix (-)(1) 대부분의 Corynebacterium은 catalase에 양성이지만 예외적으로 Corynebacterium pyogenes와 Corynebacterium haemolyticum은 음성이다.2) 동정라) Moraxella spp.는 대부분 양성이지만 Kingella kingae는 음성이며 Moraxella bovis는 양성인 균주가 있다.마) 결핵균 동정시험다. 검사 방법3) 슬라이드법 (통상적인 방법이자 Catalase 시험의 권장방법이다)가) 접종침을 이용하여 18-24시간 배양한 후 분리된 집락 중앙을 따서 깨끗한 유리 슬라이드에 도말한다.나) 슬라이드 위에 점적기 또는 파스테르 피펫으로 3% 과산화수소수 한 방울을 떨어뜨린 다음 즉시 거품이 생기는지를 관찰한다. 거품이 생기면 양성이며 거품 발생이 없으면 음성으로 판독하다. 접종침으로 집락과 7) 30% Hydrogen peroxide 원액은 검은 병에 넣어 빛에 노출되는 것을 방지해야 하며 사용하지 않을 때에는 4℃에 보관한다.8) 30% hydrogen peroxide는 피부 접촉시 화상을 유발하므로 시약을 제조할 때에는 피부와 점막에 묻는 것을 방지해야 한다. 피부에 원액이 묻었을 때에는 70% ethyl alcohol로 중화시켜야 한다. 그러므로 30% hydrogen peroxide 시약과 70% alcohol 병을 같이 보관하여 시약제조시마다 같이 꺼내어 응급 상황에 대비해야 한다.9) Hydrogen peroxide는 불안정하며 빛에 노출되면 쉽게 파괴되며 온도가 높으면 용해되는 산소량이 증가되어 위양성의 가능성이 있으므로 검사 전에 시약병을 부드럽게 흔든 후 사용해야 한다.3. 3% Hydrogen peroxide (과산화수소수)가. 제조법- H2O2 28% 수용액 10 mL와 멸균수 90 mL을 섞어 3% H2O2를 만든다.나. 주의사항1) 30% Hydrogen peroxide 원액은 검은 병에 넣어 빛에 노출되는 것을 방지해야 하며 사용하지 않을 때에는 4℃에 보관한다.2) 30% hydrogen peroxide는 피부 접촉시 화상을 유발하므로3) 시약을 제조할 때에는 피부와 점막에 묻는 것을 방지해야 한다. 피부에 원액이 묻었을 때에는 70% ethyl alcohol로 중화시켜야 한다. 그러므로 30% hydrogen peroxide 시약과 70% alcohol 병을 같이 보관하여 시약제조시마다 같이 꺼내어 응급 상황에 대비해야 한다.4) 용도Catalase 시험의 지시제4. protase펩티드결합을 가수분해하는 효소의 총칭. 저분자 펩티드에 작용하는 단백질가수분해효소는 peptidase, 단백질에 작용하는 단백질가수분해효소는 proteinase로 구분해 사용해 왔으며, 일반적으로는 protease를 사용하는 경우가 많다. peptidase는작용양식에 따라 N말단 또는 그 근처 펩티드결합이나 C말단의 펩티드결합에 작용하는 펩티는 효소로 보통 과산화효소라고도 하는데, 1942년 A.H.테오렐에 의하여 서양고추냉이에서 처음으로 결정화되었다.과산화효소라고도 한다. 기질(基質)의 탈수소반응에서 과산화수소 H2O2 를 이용해AH2＋H2O2 → A＋2H2O반응을 촉매한다. 예를 들면, 아스코르브산(비타민 C)이나 p-아미노벤조산시토크롬 등의 산화를 촉매하는 효소이다. 1942년 A.H.테오렐에 의하여 서양고추냉이에서 처음으로 결정화되었다. 식물조직 속에 널리 존재하지만 동물조직 속에는 적고, 고추냉이에 특히 다량으로 함유되어 있다. 분자량 44,000, 1분자당 1개의 프로토헤마틴(프로토포르피린에 3가의 철이 붙은 것)을 함유하는 복합단백질이며 카탈라아제와 마찬가지로 철포르피린단백질이다. 단백질 부분과 프로토헤마틴을 서로 떼어놓으면 효소활성을 잃지만 둘을 혼합하면 원래 상태로 되돌아간다. 또 프로토헤마틴의 철이나 구리, 코발트로 치환하여도 효소활성을 잃는다. 그러나 철만으로는 거의 촉매작용을 나타내지 않는다. 즉, 프로토헤마틴은 이 효소작용에 불가결한 것이다. 또 효소 자체는 프로토헤마틴 때문에 다색을 나타내지만, 이 용액에 과산화수소를 가하면 곧 녹색으로 변하고 얼마 후 적색으로 변한다. 이것은 다른 한쪽의 기질인 환원성 물질과 효소용액을 섞어도 일어나지 않는다.1949년 B.챈스가 이러한 색조의 변화를 정량적으로 추적함으로써 효소와 기질의 복합체가 형성되는 것을 처음으로 밝혔다. 녹색은 과산화수소와 효소의 복합체 때문이며, 적색은 그 환원형에 의한 것이라고 생각된다. 또 동물에서는 우유로부터 단리 ·결정화되었는데, 성질은 다소 다르다. 우유 중의 페록시다아제는 저온살균으로는 활성을 유지하지만, 고온살균에 의하여 쉽게 비활성화되기 때문에 우유 속의 페록시다아제의 존재를 조사하여 그 활성이 음성이면 고온살균이라는 것을 알 수 있다. 이것을 페록시다아제 반응시험이라고 하며 벤지딘반응이나 디티존반응 등의 방법이 있다.6. skim milk우유에서 지방성분을 뺀 것으로 탈지유라고도 한다.지방률은 에는 유전자공학의 재료로서도 주목받고 있다.Enterococcus faecalis그람양성인 연쇄상구균. 고 바야시분류의 Ⅲ형,란스필드 분류의 D군에 속한다. 대표종은 Enterococcus faecalis및 E. faecium인데, 사람이나 온혈동물의 장관 내에 상재하여 분(糞)에 나타난다. 양자 모두가 담즙에 저항성이다. 더구나 이 균은 질화나트륨에 저항성을 나타내기 때문에 질화나트륨 함유배지를 사용하여 분리한다. 병원성은 일반적으로 낮지만 드물게 아급성 심내막염이나 요로감염의 원인이 된다거나, 극히 드물게는 감염형 식중독을 일으킨다. 또한 이 균은 분유래 균이기 때문에 식품이나 공공용수 등의 분오염지표로 이용된다.slide glass과산화수소 : 위에서 자세히 설명하였다.멸균 정제수clean bench물리적으로 격리한 상자형의 구조 내에 공기의 수직층류를 형성하여 극력미진입자를여과할수있는필터(헤파필터 등)로 미립자나 균을 제거한환경에서 미립자나 미생물, 유전자 DNA 등이 밖으로 흩어지지 않게 조작할 수 있도록 고안한 기기. 적층회로를 만드는 방등 미립분진의 혼입이나 산란이 차단되는 장소나 병원의 수술실 및 유전자조작을 실시하는 장소에서는 필수적인 설비이다.pipet일정한 용량의 용액을 정확하게 취하고 투입하기 위해 사용하는 기구이다. 2㎕~1,000㎕의 용량을 다룰 수가 있다.(1,000㎕=1㎕) 다루는 용량에 따라 2㎕파이펫, 10㎕파이펫, 20㎕파이펫, 100㎕파이펫, 200㎕파이펫, 1000㎕파이펫 등 종류가 다양하다.사용할 때에는 파이펫의 종류에 따라 파이펫의 끝에 pipette tip(파이펫 팁)을 꽂아 사용하게 된다.autoclave압력을 가해 물의 끓는 점을 121도로 높인 다음 발생하는 수증기로 멸균하는 방식을 오토클레이브, 고압증기멸균기라고 한다.먼저 뚜껑을 열고 물을 적당량 넣는데, 이 때 사용하는 물은 증류수로 하되 이온교환수지를 거친 물은 피하는 것이 좋다. 다음 멸균을 원하는 용액이나 기구를 넣고 뚜껑을 닫은 다음 온도를 맞추고(1다.

자연과학| 2011.10.06| 14페이지| 3,000원| 조회(383)

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병원미생물학실험_report_5_(항균성실험)

병원 미생물학 실험 결과report1. Subject항균성실험2. Object흔히 사용되는 항생물질을 이용하여 항생제에 대한 미생물의 감수성 정도를 측정한다.3. Principle한 환자의 특정 질병에 대한 원인 박테리아 물질이 동정되면, 의사는 환자에게 심각한 해를 일으키지 않는 병원균을 죽이거나 혹은 저해하는 화학치료 물질에 대한 처방을 내려야 한다. 항생제와 같은 화학치료 물질은 많은 병원성 박테리아에 대한 다양한 효과를 가진다. 예를 들어서 몇몇 항생제들은 그람 양성박테리아 혹은 그람 음성박테리아에 대해 더 효과적이며, 다른 것들은 넓은 범위의 병원체에 효과를 가지고 있거나 전자와 후자 모두에 대해 사용되기도 한다. 항생제와 항균제는 특정 병원체에 대한 검사가 반드시 시행되어야 하는데 이는 그 개체가 특정 물질(항생제 및 항균제)에 대해 민감한지 혹은 저항성이 있는지 결정해야 하기 때문이다. 이것은 비교적 간단한 검사 방법으로, 가능한 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있고 신뢰도가 높다. 민감도 검사인 Kirby-Bauer법은 항생제와 항균제를 검사하기 위한 한 방법이다. 항생제(antibiotic)는 보통 분자량이 작고 미생물에 의해 생성이 되며 다른 미생물들을 죽이거나 저해할 수 있는 화합물이다. 페니실린과 스트렙토마이신은 항생제의 대표적인 것들이다. 반면에 항균제(antimicrobial)는 다른 미생물을 죽이거나 저해할 수 있는, 화학적으로 합성된 물질이다. 페니실린이 발견되어 적용되기 이전에 사용되던 술파제(sulfa-drug)가 그 예이다. 그러나 항생제는 그들의 효능 및 작용 양상을 향상시키기 위해 분리 후 화학적으로 변형되는 일이 잦다는 것을 기억하자. 두 개념에 대한 정의는 모호하기 때문에 종종 상호교환되어 사용되기도 한다. 항생제와 항균제 모두 항균 민감도 검사 방법을 바탕으로 이 단원에서 검사될 것이다.검사는 검체를 배지에 균일하게 접종함으로써 수행된다. 특정 농도의 항생제 혹은 항균제를 함유한 디스크를 한천 배지 표면에 올려놓는다.ilution technique)이라고도 한다.MIC는 사용하는 균주의 성질, 접종량, 배지의 조성, 배양시간 및 온도, pH, 통기 등의 배양조건에 따라 달라지므로 항미생물제의 MIC는 절대적일 수는 없다. 그러나 모든 조건을 철저히 표준화하면 여러 종류의 항미생물제를 비교하여 특정 미생물에 가장 효과적인 것을 결정할 수 있다. 항미생물제를 비교하기 위해 사용되는 표준 방법은 페놀 상수법(phenol corfficient method)으로 같은 균주와 같은 배지 및 생장 조건에서 특정 항미생물제의 MIC와 페놀의 MIC의 비가 된다.2. 항균제의 분류가. 화학구조에 따른 분류나. 생화학적 작용에 의한 분류1) 살균성 (bacteriocidal)가) 세포벽 합성 장애- Penicillin(Ampicillin), cephalosporins, bacitracin, vancomycin, 등나) 세포막 기능 장애- Polymixins, Colistin, polyene (Amphotericin B, nystatin)2) 정균성 (bacteriostatic)가) 주로 핵산 합성 장애- Sulfa, actinomycin, novobiocin, trimethoprim, nalidixic acid, 등나) 단백질 합성 장애- Tetracyclines, chloramphenicol, macrorides, Aminoglycosides, macrolide, 등3. 항균제 내성 기전균의 약제 내성 기전은 비유전적 및 유전적인 요인으로 나누어진다. 비유전적인 요인으로는 결핵균처럼 복제의 불활성화와 돌연변이에 의해 내성을 나타내거나 L-form 세균처럼 표적부위의 손실로 내성을 유발할 수 있다. 유전적인 요인은 균 자체의 필수 물질은 변화하지 않고 항균제를 세포질 외에서 불활화하거나 표적부위의 구조가 바뀌어 내성을 나타낸다. 내성인자의 위치는 염색체 또는 염색체 이외의 부위에 plasmid로 존재한다. 내성 유전자는 transduction, transformation, conjugati균성을 확인해야 한다. 자동분주기를 사용하면 배지 높이를 정확히 맞출 수 있다.나. 배지의 PH새로운 lot의 한천을 사용할 때는 배지의 pH를 측정하여 7.2-7.4 범위에 드는지를 확인한다. 배지의 pH가 너무 낮으면 aminoglycosides와 macrolides 약물은 역가가 감소할 수 있고 penicillin 등은 역가가 증가할 수 있으며 pH가 높으면 반대 현상이 발생한다. pH 측정은 실온에서 pH electrode로 측정한다. 배지는 사용전에 실온에 꺼내어 습기를 제거한다. 습기가 많을 경우에는 35℃ 배양기나 laminar flow hood에서 배지 뚜껑을 일부 열어 놓은 채로 10-30분간 말린다. 배지 또는 petri 접시 뚜껑에 물방울이 있으면 안된다. MHA 배지의 Mg++과 Ca++ 농도에 따라 너무 높으면 억제대가 줄어 들고 낮으면 커진다. 특히 Mg++과 Ca++ 농도 변화는 Pseudomonas의 aminoglycoside, tetracycline 및 colistin의 결과에 영향을 줄 수 있다.다. Mueller Hinton agar의 조성 (1ℓ)Beef extract(쇠고기 추출물)2 gAcid hydrolysate of casein(카제인 추출물)17.5 gStarch(녹말)1.5 gAgar(우뭇가사리 : 해조류, 바닷말의 일종)17.0 g라. Mueller Hinton agar의 제조방법1) 증류수 4ℓ에 Mueller Hinton agar 152g (38g / 1ℓ)을 넣고 분말이 완전히 녹을 때까지 잘 섞은 후 1분간 가열하여 녹인다 (pH; 7.3±0.1).2) 121℃에서 15분간 멸균한 후 45℃로 식힌 뒤에 배지 두께가 4mm가 되도록 배지 분주량을 조절한다.3) 4℃에서 냉장보관한다.6. 항균제 디스크직경이 6 mm인 종이 디스크에 항균제가 함유되어 있다. 디스크의 항균제 함량은 NCCLS에서 추천한 것을 사용하며 여러 회사의 상품화된 제품이 있다. 항균제 디스크 보관통은 8℃이하에 보관하거나 -14℃이하로을 맞추어야 한다.9. 균종별 디스크 확산법의 배양조건과 배양시간10. 디스크 확산법의 장점과 단점가. 장점1) 실시하기가 간편하며 병원에 따라 원하는 항균제를 자유롭게 선택할 수 있다.2) 시험방법을 잘 지키면 상당히 정확하고 재현성있는 결과를 얻을 수 있다.3) 검사비용이 저렴하다.나. 단점1) 비교적 빨리 증식하는 병원균에서만 적용할 수 있으므로 혐기성 세균, 증식이 느린 세균, MHA에서 증식하지 않는 세균은 시험할 수 없다.2) Polymyxin B와 E(colistin)는 확산성이 나쁘기 때문에 그 결과가 정확치 않다.3) Thymidine이 다량 함유되어 있는 lot의 경우는 trimethoprim/sulfamethoxazole의 항균력이 감소된다. 그러므로 MHA배지는 thymidine이 없는 제품을 사용해야하며 이를 확인하기 위하여 trimethoprim/sulfamethoxazole (1.25/23.75 μg) 디스크를 E. faecalis (ATCC 29212 또는 33186)로 시험하여 억제대 안에 작은 세균집락이 없으며 억제대가 20 mm이상인 배지를 사용한다.11. 판정감수성이나 내성의 해석기준은 항균제의 보통 용량을 투여했을 때의 혈중 농도를 기준으로 하고 있으며, 요로감염에만 쓰이는 nalidixic acid 등의 경우에는 요중 농도를 기준으로 하고 있다.가. 감수성(Susceptible)일반적으로 그 균종의 감염에 추천되는 항균제를 보통 용량 투여했을 때 치료될 수 있을 것임을 뜻한다.나. 중간(Intermediate)기술적인 오차발생으로 인하여 결과를 잘못 판단하는 일이 없도록 완충구역을 만든 것이다. 검사한 약제들 중에서 감수성을 보인 항균제가 있으면 그 약제를 사용하고 중간으로 보고된 항균제는 사용하지 않는다. 감수성인 약제가 없는 경우에는 중간인 항균제의 최소억제농도를 측정한 후 사용한다.다. 내성(Resistant)일반적으로 그 균종 감염에 권장되는 항균제를 보통 용량을 투여해서는 치료되지 않을 것임을 뜻한다.12. 연속 한다. 이러한 단백질을 합성하는 작업을 통해 세포는 스스로를 성장시키고 필요 물질들을 만들어 생존하게 된다.그런데 이 리보솜이란 구조에 문제가 생긴다거나, 정상적인 작동에 방해를 받게되면, 세포 혹은 세균이 스스로의 생존에 필요한 단백 물질들을 못 만들게 되고, 결국 세포는 자명하고 만다. 세균뿐만 아니라 사람의 세포에도 리보솜이 존재하지만, 박테리아의 리보솜은 인간의 리보솜과는 구조가 다르기 때문에, 이 계열의 항생제는 일반적으로 인체에는 해가 없다(미토콘드리아의 경우는 예외). 자세히 살펴보면, 스트렙토마이신 등의 아미노글리코사이드 계열의 항생제들은 리보솜과 RNA가 일단 정상적으로 결합하는 작용을 차단하고, 리보솜이 RNA정보를 해독하면서 그에 적합한 펩타이드 체인을 형성하는 것을 차단하고, (잘못 해독하여 다른 단백질을 만들게 유도하는 등) 마지막으로 해독하여 단백질을 만드는 과정을 끝까지 하지 못하게 중간에서 끊기게 만들어 버리는 작용을 한다.15. 각 항생제의 작용의 억제가. 페니실린 계열엠피실린과 같은 페니실린 계열의 모든 약물을 흔히 베타-락탐 계열 약물이라고 한다. 모든 베타-락탐 계열의 약물들은 세포벽 합성을 방해하는데, 이와 같은 종류의 항생제에 저항을 가지는 세균들은 일반적으로 아래의 몇가지 기전으로 항생제 작용을 억제한다.1) 세균 스스로 베타-락탐 계열의 항생제를 파괴하는 효소를 만들어 저항하는 방법 (흔히 베타-락타메이즈라고 한다.)2) 세포 외막의 투과성 감소 : 항생제가 세포(세균) 안으로 들어오지 못하게 하는 것이다. 투과성이 감소되므로 항생제 성분이 아예 들어오질 못한다.3) 결합장소 변화 : 페니실린 등이 세균 안으로 성공적으로 들어왔다 해도 PBP라는 수용체에 적합하게 결합하여야 효과를 발휘하는데, 세균 스스로 이 결합장소를 바꾸어 버림으로서 항생제의 작용을 방해한다.나. 아미노글리코사이드 계열1) 마찬가지로 항생제 자체를 불활성화 시키는 어떠한 효소의 생산(인산화, 아데닐화 아세틸화 등등).2) 결합장소 변경 : 이 경

자연과학| 2011.10.06| 20페이지| 3,000원| 조회(338)

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병원미생물학실험_report_4_(박테리아 생장곡선)

병원 미생물학 실험 결과report1. Subject박테리아 생장곡선2. Object세균을 대량 배양할 때나 또는 조사해야 할 시료의 수가 많은 경우에는 배양액의 흡광도를 측정함으로써 세균의 생장을 측정해 볼 수 있다. 이번 실험에서는 배양액에서세균의 생장곡선을 흡광도 측정방법으로 구해보고 또 정확한 균체수의 측정을 위하여 콜로니 계수법을 병행해 보도록 한다.3. Principle1. 생장 및 사멸가. 생장생물계에서 정의하고 있는 생장(growth)이란 일률적으로 화학적 구성성분이 증가되는 것을 의미한다. 특히 미생물이 생장할 때에는 외부로부터 영양분을 흡수하여 핵산, 단백질, 효소 및 기타 거대분자로 전환시킨 뒤 세포벽 성분이 합성되고 세포의 크기도 증가한다. 세포가 세포분열을 수반하지 않은 저장물질, 협막이나 수분 등의 물질만을 단순히 증가시키는 것과 같은 특정 세포 성분의 증가는 진정한 의미의 생장이 아니다.세균과 같은 단세포 생물의 경우에는 세포수의 증가가 생장의 기준이 되지만, 곰팡이나 일부 효모와 같이 균사의 신장에 따른 생장의 경우는 세포 수 측정이 곤란하여 생장 판정이 곤란하다. 따라서 다수의 세포를 연결하거나 또는 덩어리로 생장하는 형태의 미생물은 세포량(건조중량) 혹은 특정 세포성분(질소, 단백질)의 증가를 생장의 기준으로 한다.따라서 미생물의 생장이란① 환경으로부터 세포 내에 기본적인 영양물질이 흡수되는 현상② 유기물질이 에너지나 세포 구조물로 변화되는 현상③ 염색체의 복제④ 세포크기와 용량의 증가⑤ 유전자와 세포 복합물을 함유한 세포의 분열을 의미한다.나. 사멸미생물의 사멸은 생장(재생) 능력이 불가역적으로 잃은 상태를 말한다. 그러나 미생물에 따라서는 간혹 예외가 있는 경우도 많이 있다. 즉 미생물 세포에 약한 X-선이나 방사선을 조사하거나 독물로 약하게 처리할 때는 자기 생장능력은 불가역적으로 상실되지만 그 외의 생리적인 면에서는 정상적 세포와 별 차이가 없는 반응을 나타낼 수도 있으므로 이 양자를 구별하기는 힘들다.미생물의 사멸은 강다음으로 세포막의 내곡이 일어나 D N A와 연관을 맺으면서 세포질 내부를 향해 횡막을 형성한다. 그러는 동안 세포벽을 이루는 물질이 세로 증산되면서 두 개의 세포로 나누어진다. 새로운 세포벽 형성물질이 모세포의 벽의 어느 부위에 증산되느냐 하는 것이 세균의 종류에 따라 다르다. 일반적으로 그람양성구균은 모체의 중앙부위에 새 세포벽 물질이 증산되며, 그람음성간균은 모체의 여러 곳에서 동시에 증산된다.다. 집단생장미생물은 크기가 미세하므로 미생물의 생장을 연구하기 위해서 개체성장보다는 집단성장을 살펴보는 것이 보다 타당하다. 미생물의 세포의 집단성장은 한세포가 분열할 때마다 두 개의 세로가 되므로 2n , 즉 2의 지수적 비율로 증가한다.시간에 따른 세포수의 증가는 대수적으로 같은 성장속도로 증가하고, 산술학적으로는 시간이 지남에 따라 급속하여진다. 따라서 최적 환경 아래서 모든 단일 세포성 미생물은 대수학적 생장세를 보인다.미생물의 생장속도를 세대시간으로 표현하는데 세대시간은 미생물집단의 크기가 두 배로 증가하는데 걸리는 시간이다. 또 단위시간에 일어나는 분열횟수로써 표시하기도 한다.일부 미생물의 세대시간미생물의 세대시간은 시간에 따른 세포수를 대수적 용지에 표시한 직선에서 산출할 수 있다. 그러나 때로는 시간에 따른 미생물의 생장을 수식으로 표현하는 것이 편리하기도 하다.출발시간의 세포수를 X0, 일정한 시간이 경과된 후위 세포수를 Xt, 단위시간에 일어난 분열 회수를 K, 세포수가 두배로 되는 데 필요한 시간을 g라고하면,Xt=2ktX0이를 기본수 2의 대수로 표시하면log2Xt / X0 = Kt 또는K = (log2Xt - log2X0) / t이것을 기본수 10의 대수로 바꾸면K=(log10Xt-log1010X0) / 0.301t이 때 g=l/k 이므로 위의 식에서 쉽게 세대시간 g를 구할 수 있다.예를 들면 1000개의 세포가 5시간 후 100000개로 증식했다면K = (log10000 - log1000) / (0.301 x 5) = 1.33따라서 세대물의 수: 변동 없는 시기4) 사멸기(Death phase)- 사멸 세포수의 증가 → 생존 미생물의 수 감소 시기- 미생물의 종류에 따라 사멸기의 기간 다르다- 생균수 급격히 감소, 현탁도는 서서히 감소(사멸균의 용해(lysis) 까지 상당 시간 소요)3. 미생물의 생장 측정1) 흡광도 측정법흡광도 측정은 세균을 대량으로 배양할 때나 조사해야할 시료의 숫자가 많은 경우에 주로 사용하는데, 세균 배양액에 이러한 파장의 빛을 통과시켰을 때 용액을 그 빛을 흡수 또는 산란시킬 수가 있는데, 이 때 흡수된 빛의 양은 용액의 세포농도에 비례함을 이용한 것이 흡광도 측정이다.시료를 투과한 빛은 광전관을 거쳐서 검류계에 백분율로 표시되는데, 이 때 시료속의 균체가 많을수록 통과되는 빛의 양은 당연히 줄어드니까 여기서 투과된 빛의 양은 시료속의 균체 수에 반비례하는 것을 알 수 있다.따라서, 여러 가지 비율로 희석된 배양액의 흡광도를 잰 다음, 각 흡광도에서의 정확한 세포 수를 알아내어 이들의 상관관계를 구해 놓으면 흡광도 측정만으로도 미지의 균체 수를 알아 낼 수 있다.2) 평판계수법(plate count)하나의 단일 콜로니는 하나의 세포 즉, 하나의 세균에서 형성된 것이므로 단일콜로니 하나는 균 하나라고 본다. 이 콜로니가 자란 것은 하나의 세포에서 시작된 것이기 때문이다.페트리접시(평판배지)에 액체배양액에서 자란 균을 희석하여 마이크로피펫으로 떨어뜨려서 Spreading도말방법으로 도말을 한 뒤 자란 단일콜로니의 수를 센 후에 희석 배수만큼 곱하여 원액의 생균수를 측정한다. 이 생균수측정법이자 평판배양법이다. 여기서 배지에 형성되는 집락의 수가 너무 많지 않게 하는 것이 중요하다. 너무 많은 수의 생균을 접종하면 평판 위에서 몇몇 세포는 집락을 형성하지 못하거나 집락끼리 겹쳐지는 경우가 발생해 측정에 오차가 많이 생길 수도 있기 때문이다. 집락의 수가 너무 적으면 생균 측정의 통계학적 유의성이 낮아지기 때문에 적정수의 집락이 형성될 수 있도록 해야 한다. 대개의 경우 마다 다르지만 최적온도는 항상 최저온도보다 최고온도에 가깝다.기본생장온도는 고정된 것이 아니라 pH나 주변의 영양물질 농도에 따라 어느 정도 달라질 수 있다.※ 생장 가능한 온도 범위에 따라 분류한 5가지 종류① 호냉성생물(psychrophile)0℃에서도 잘 자라고 최적생장온도는15℃ 또는 그 이하. 최고온도는 대개20℃정도이다. 바다의90%가5℃이하이므로 북극과 남극은 호냉성생물의 좋은 서식처가 된다.② 조건부호냉성생물(facultative psycrophile) 또는 내냉성(psychrotroph)최적온도는20~30℃이고 최고온도는35℃지만0~7℃사이에서도 자랄수 있는 생물이 많이 있다. 이런 세균이나 곰판이가 냉장보관된 식품을 변질시키는 주된요인이다.③ 호중온성생물(mesophile)생장온도는 20~45℃이고 최저온도는 보통15~20℃, 최고온도는 대략45℃이거나 그 이하. 대부분 미생물이 여기에 속한다. 주변 환경의 온도가 거의 일정하게37℃를 유지하므로 인간에게 병을 일으키는 거의 모든 균은 호온성이다.④ 호열성생물(thermophile)55℃이상에서 생장 가능. 최저온도는 보통45℃정도이고, 최적온도는 55~65℃정도인 경우가 많다. 이들 미생물은 막지질에 호온성생물보다 포화지방산이 많이 포함되어 있어 녹는점이 더 높다. 그래서 높은 온도에서도 안정하게 유지 될 수 있다.⑤ 극호열성생물(hyperthermophile)호열성균 가운데 90℃이상에서도 자랄 수 있고, 심지어 100℃가 넘는 곳에서도 생장하는 종류도 있다. 생장최적온도가 80~113℃정도인 원핵생물이다. 이들은 55℃이하에서는 생존하지 못한다.2) pH수소 이온농도(pH)는 용액 중에 H+가 얼마나 들어있는가를 나타내는 단위로서 용액 ℓ당 수소이온농도가 얼마만큼 들어있는가의 값을 수소이온농도 10을 기본으로하여 역대수로 나타낸 것이다. 물은 일정량 해리되어 수오시온과 수산화이온으로 존재한다. 그러나 해리된 물 분자의 수는 극히 작아서 25℃ 순수한 물은 물 천만 분자 중 1분자(10-7으므로, 산소호흡을 하지 않는다.2) 삼투압삼투압은 농도가 다른 두 용액을 반투막으로 막았을 떼 농도가 낮은 쪽에서 높은 쪽으로 용매가 이동하면서 나타나는 압력으로, 미생물의 세포막은 반투막으로 되어 있다. 삼투압을 견딜 수 있는 능력은 미생물에 따라 다르다. 예를 들어 호염균 (짠물에 사는 미생물)은 삼투압 내성이 아주 높아서 사멸되지 않고 잘 증식할 수 있다. 예를 들어 식품을 소금에 절인다면 소금의 양이 많아서 용액의 농도가 상승하고 이에 따라 삼투압도 높아지게 되고, 따라서 미생물의 세포막 안쪽에서 외부(소금물)로 물이 빠져나가게 된다. 그 결과는 당연 세포가 쪼글쪼글해 지면서 세포막이 제 기능을 못하게 되므로 대사활동에 문제가 생겨 생육이 저해된다.4. Apparatus & Reagents장구균(Enterococcus faecalis) : 그람양성인 연쇄상구균. 고 바야시분류의 Ⅲ형,란스필드 분류의 D군에 속한다. 대표종은 Enterococcus faecalis및 E. faecium인데, 사람이나 온혈동물의 장관 내에 상재하여 분(糞)에 나타난다. 양자 모두가 담즙에 저항성이다. 더구나 이 균은 질화나트륨에 저항성을 나타내기 때문에 질화나트륨 함유배지를 사용하여 분리한다. 병원성은 일반적으로 낮지만 드물게 아급성 심내막염이나 요로감염의 원인이 된다거나, 극히 드물게는 감염형 식중독을 일으킨다. 또한 이 균은 분유래 균이기 때문에 식품이나 공공용수 등의 분오염지표로 이용된다.대장균(Escherichia coli) : Gram 음성의 간균으로(2∼4)×(0.4∼0.7)㎛의 크기. 배양하기 쉽고 세균의 접합현상(conjugation), phage에 의한 형질도입(tr- ansduction)등 원핵생물이면서 유전적 해석이 되기 때문에 분자유전학의 대표적인 재료로서 옛날부터 사용되었다.TSB 액상배지Tryptic Soy Broth 만드는 법- 증류수 1L + Tryptic Soy Broth 30g 희석 시킴- 10% Nacl 만드는 법: 증류수 사용량(1000

자연과학| 2011.10.06| 22페이지| 3,000원| 조회(336)

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병원미생물학실험_report_3_(단순염색 및 그람염색)

병원 미생물학 실험 결과report1. Subject그람 염색 및 단순 염색법2. ObjectGram 염색에 의한 세균 감별염색(differential staining)방법을 익히고, 세균의 Gram양성(Violet 색) 및 음성(적색)에 따르는 분류와 염색성의 원리, 방법, 기본지식을 이해한다.3. Principle일반적으로 대부분의 미생물은 무색투명하여서 이들의 세포를 현미경으로 세밀하게 관찰하기 위해서는 염색과정을 거치는 것이 좋다. 일반적으로 염색은 염료가 세포에 부착이나 흡수되는 것에 의한 물리적 방법과 염료와 세포구성물 사이의 전기적 전하와 화학적 친화력에 의해 염색되는 화학적인 방법이 있다.가. 염색의 종류1) 단순염색 (Simple stain)가) 세균의 형태 : cocci, bacilli, spitrilli나) 배열 관찰 : chains, clusters, pairs, tetrads2) 감별염색 (Differential stain)가) 미생물 그룹의 분류 : Gram stain, Acid fast stain나) 특수 구조의 관찰 : Flagella stain, Capsule stain, Spore stain, Nuclear stain식품 등에서 분리한 미생물이나 표준균주를 우선 순수 배양한 다음 염색 처리한 후 그 형태 및 Gram 염색성 그리고 생리학적인 여러 가지 성질을 조사한 다음 그 결과를 기지의 균종의 특성과 비교 검토하여, 속 및 종을 결정하는 것을 동정(identification)이라 하는데, 우선 분리한 균이 세균인지, 효모, 곰팡이, 방선균 또는 조류의 어느 군에 속하는지를 조사하고 나서, 그 다음에 그 미생물 군에 관한 전문서적을 이용하여 속 및 종을 동정한다.나. 단순 염색(Simple Staining)단순염색법을 이용하여 관찰한 Corynebacterium diphtheriae세균의 크기(size)는 0.2~수백㎛정도의 범주에 속하나 크기가 다양하다. 그러나 폭이 1.1~1.5㎛이고 길이가 2.0~6.0㎛정도인 대장균과 같lide glass를 놓았을 때 건조된 도말 면을 통해 글자가 보일 정도의 상태가 좋다.3. fixing(고정) : 도말 면을 위로 하여 alc.lamp의 화염 속을 서서히 3~5회 왕복하여 통과시키는 조작으로, 도말한 미생물의 멸균 및 slide glass상에 밀착 시키는데 고정의 목적이 있다. 미생물은 단백질이 함유되어 있기 때문에 이 조작에 의해 응고되어 slide galss상에 밀착되는 것이다. 주의할 점은 너무 지나치게 가열하여 미생물이 수축되지 않도록 해야한다.4. staining(염색) : 위의 시약 조제항에서 만든 어느 시약이든 관계가 없다. 즉, 염색액을 도말 면 보다 좀 더 넓게 떨어뜨린 후 1~2분간 정치하면 된다.5. washing(수세) : 도말 면을 밑으로 하여 조용히 흐르는 수돗물을 slide glass위에 떨어뜨려 자연스럽게 흘러내리게 하여 세척한다(Back washing). 수세의 end point는 흘러내리는 세척수가 무색이 될 때까지이다.6. drying(건조) : slide glass를 filter paper나 Kleenex tissue로 싸서 여분의 물기를 흡수한 다음 2.에서와 같이 공기 중에서 자연건조하거나 water bath의 뚜껑 위에서 또는 alc.lamp의 화염 위 먼 곳에서 건조한다.7. microscopy(검경) : 세균은 미생물 중 가장 작기 때문에 1000배 정도의 고배율에서 관찰해야 형태가 겨우 보인다. 그러나 이정도의 배율에서는 시야가 어두워 관찰할 수 없으므로, 관찰하고자 하는 도말 면에 cedar oil을 한 방울 떨어뜨려 유침계(oil immersion lens)를 만든 다음 관찰한다. 이 때 cedar oil을 사용하는 이유는 현미경의 해상력을 높여주기 위해 빛을 모아주는 역할을 하기 위해서 이다.8. 관찰이 끝난 후 현미경 및 slide glass에 묻은 cedar oil은 xylene을 묻힌 거즈나 Kleenex를 이용하여 닦아낸다.9. 검경한 표본을 장기간 보존키 위해서는 canadabal은색으로 관찰된다.위 그림은 그람 염색 과정의 각 단계에서 나타나는 세균의 색을 도해하였다. 그람 양성균과 그람 음성균 모두 처음에 크리스탈 바이올렛으로 염색한다. 그 다음 단계에서 요오드(Gram's iodine)를 도말 시료에 첨가한다. 요오드는 매염제(mordant)로 작용하여 그람 양성균은 크리스탈 바이올렛과 불용성의 복합체를 형성한다. 여기까지는 그람 양성균과 음성균 모두 동일하게 자색을 나타낸다.그람 음성균의 경우 색소와 매염제 복합체는 탈색과정에서 알코올이나 아세톤에 의해 탈색되지만 그람 양성균은 탈색되지 않는다. 따라서 탈색과정 후에도 그람 양성균은 보라색을 띄고 있으나 그람 음성균은 색이 없어지게 된다. 그리고 최종단계에서 대조염색을 하는 사프라닌이 색이 없는 그람 양성균에 염색된다. 그러나 크리스탈 바이올렛은 사프라닌보다 더 색이 강해 그람 양성균은 계속 보라색으로 남아있게 된다.Q. 어떤 이유로 그람 양성균과 그람 음성균이 이와 같은 차이를 보이는가?A : 바로 세포벽의 화학적 조성이 다르기 때문이다.전자 현미경으로 관찰하면 그람 양성균은 세포벽을 구성하는 펩티도글리칸 층이 두껍게 쌓여있는 것을 확인할 수 있다. 그 반면에 그람 음성균은 그람 양성균에 비해 매우 얇은 펩티도글리칸 층을 갖고, 그 바깥쪽에 외막이 둘러싸고 있다. 이 뚜렷한 구조적 차이점에 의해 그람 음성균의 경우 색소-매염제 복합체가 제거되고 그람 양성균의 경우 남아 있게 된다.미생물학에서 사용되는 모든 염색법 중에서 그람 염색법은 가장 중요한 염색법중 하나이다. 이 염색법은 미지의 세균을 동정하는데 있어 매우 중요하기 때문에 많은 실험에서 일상적으로 사용된다. 비록 이 그람 염색법은 아주 간단한 실험법이지만, 정확한 결과를 얻기 위해서는 많은 경험이 필요하다. 여러 변수들이 이 실험법의 결과에 영향을 줄 수 있다.※주의사항1. 16~18시간 동안 배양된 세균을 사용해야만 한다. 이 시간보다 오래 배양된 그람 양성균은 그람 부정균(gram-variable)이나 그람 음성균으로 paper나 Kleenex로 흡수한다.10. count staining(후염색) : safranin soln.으로 30초~1분간 후염색한다. 이때 8.의 탈색조작에서 탈색된 gram(-)균이 pink~적색으로 염색된다.11. washing(수세) : 가볍게 수돗물로 수세 후 filter paper나 Kleenex로 흡수한다.12. drying(건조) : slide glass를 filter paper나 Kleenex tissue로 싸서 여분의 물기를 흡수한 다음 2.에서와 같이 공기 중에서 자연건조하거나 water bath의 뚜껑 위에서 또는 alc.lamp의 화염 위 먼 곳에서 건조한다.13. microscope(검경) : 세균을 관찰한 경우는 cedar oil을 사용할 것. 현미경에 의한 관찰이 끝난 후에는 대물 lens나 slide glass에 묻은 cedar oil를 사용하여 깨끗이 닦아 낼 것.라. 현미경현미경은 광학현미경, 전자현미경, 투과현미경, 주사현미경 등 여러 종류가 있으나, 본 실험에서는 광학 현미경을 사용하므로, 광학 현미경에 대해 자세하게 알아보자.광학 현미경은 가장 기본적인 현미경으로 시료를 통과한 빛을 바로 보는 형태이다. 광학 현미경은 생물학, 미생물학을 전공하는 학생들이 가장 처음 다루는 광학기기이다. 모든 광학 현미경은 공통점이 있으나, 기계적 구조와 작동의 차이로 다양한 형태의 광학 현미경이 있다. 이 차이점과 같은 점은 앞으로 실험과정을 통하여 배울 것이며, 학생들은 자기의 목적에 맞는 현미경을 다룰 수 있게 된다.3) 사용상 주의할 점가) 운반할 때 - 현미경을 운반할 때에는 반드시 양손을 사용하여야 한다. 오른손으로는 현미경의 손잡이를 단단히 잡고 왼손으로는 몸통 바닥을 단단하게 받들어 주어야한다. 한손으로 들고 가면 현미경이 흔들리면서 렌즈 등 부착된 것들이 ㄸ?ㄹ어질 수 있으며, 본체가 다른 물체에 부딪쳐 훼손될 수가 있다. 현미경 운반도 실습시간에 포함되는 것이므로 반드시 현미경 운반 과정이 끝난 후 실습시간이 종료 정확하게 그림을 그릴 수 있다. 두 개의 접안렌즈가 설치된 경우 관찰자의 두 눈이 초점거리가 서로 다르므로 보정하는 장치가 있다. 또 두 눈 사이의 거리가 사람마다 다르므로 이 거리를 보정하는 장치도 있다. 대개의 경우 10×10배율의 대안렌즈를 사용하며, 특수한 경우 5×와 15×의 배율을 사용한다.대물렌즈(objective)는 배율이 다른 3~4개가 노즈피스(nose piece)에 부착되어 있으며 빙글빙글 돌아가도록 되어 있다. 실험이 끝난 후에는 항상 낮은 배율의 대물렌즈가 정위치에 놓여 있어야한다. 대물렌즈들은 배율은 다르지만 축은 항상 일치하도록 만들어 졌으며, 초점거리도 비슷하게 되어있다. 즉, 저배율로 초점을 맞춘 후에 고배율의 대안렌즈로 볼 경우 초점거리는 약간 이동하면 맞춰진다. 흔히 사용되는 대물렌즈의 배율은 10×, 40×, 100×이며 4×도 사용된다. 100×는 오일(immersion oil)을 사용하여 시료를 관찰한다.마지막 렌즈 시스템은 콘덴서이다. 콘덴서는 스테이지 밑에 붙어있으며 광원으로부터 나온 빛을 모으고 광도를 조절하는 역할을 한다. 이 콘덴서는 상하로 이동이 가능하며 조리개가 붙어 있어 광도를 조절한다.위 그림은 광원으로부터 나온 빛이 콘덴서, 대물렌즈와 대안렌즈를 거쳐 우리의 눈에 상이 맺히는 과정을 보여준다.초점조절나사(focusiong knobs) : 현미경의 기능을 확인하는 가장 중요한 부품이다. 대물렌즈와 시료간의 거리를 조절하는 나사로 조동 조절 나사(coarse adjustment knob)와 미동 조절 나사(fine adjustment knob)로 구성되어 있다. 조동 조절 나사는 저배율로 관찰할 때에 초점을 찾기 위하여 사용하고, 미동 조절 나사는 정확한 초점을 찾을 때에 사용한다.접안렌즈 정렬 : 접안렌즈가 두 개로 구성된 경우, 반드시 두 개의 렌즈 사이의 거리를 맞추고 두 눈의 굴절률이 다른 것을 보정하여야 한다. 접안렌즈가 붙어 있는 패널을 좌우로 당기거나 밀면서 두 눈 거리에 맞도록 접안렌즈의 위

자연과학| 2011.10.06| 23페이지| 3,000원| 조회(525)

그람염색, 염색, 병원미생물학, 단순염색, 미생물 염색, 병원미생물학실험, 병미실험, 병미

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병원미생물학실험_report_2_(미생물 순수배양)

병원 미생물학 실험 결과report1. 제목미생물의 순수분리 및 배양2. 실험목적여러 종의 미생물이 혼합된 시료나 배양액에서 균 분리 기술을 습득하고, 순수 배양을 위한 각종 기구 및 장비 사용 방법에 대해 알아본다.3. 원리미생물을 연구하기 위해서는 병원균, 산업용미생물 등 그 목적으로 하는 미생물을 순수하게 분리, 배양하는 일이 중요하다. 재료에 따라서는 목적균을 거의 순수하게 얻을 수 있으나 대개의 경우는 목적하지 않는 다른 미생물과 혼재하고 있어서 이들은 소위 잡균(saprophyte)으로부터 분리하지 않으면 안된다. 이 방법이 분리 배양법으로 순수배양을 얻기 위해서 하는 것이다. 보통 고형평판배지를 사용하고 도말 또는 혼화법으로 재료중의 미생물에게 각각 독립한 집락(colony)을 만들게 하고, 그 집락군 중에서 목적균의 집락을 찾아 그 집락만을 새로운 배지에 심어서 순수배양을 한다. 분리를 용이하게 하기 위하여 미생물의 성질에 따라 특별한 분리용 배지를 쓰기도 하고 집적법, 증식법 등의 전처리 방법을 쓰기도 한다.미생물은 최적의 영양물질을 함유하고, 최적의 환경조건(온도, pH, 호기성 또는 혐기성 등)하에서 생장 증식한다.그러나 같은 종류의 미생물이 같은 장소에서 생육하고 있는 것은 드물기 때문에 이것만을 순수 분리하여야 한다.1. 평판배양법가. 도말평판법 (Spread-plate)순수배양된 집락을 얻는 직접적인 방법이다. 30~300개 정도의 세포를 포함하는 미생물 혼합액을 한천배지의 중심에 조금 덜어 구부러진 유리봉을 멸균하여 전체적으로 펴서 도말한다. 이 과정에서 흩뿌려진 세포는 각각 분리된 집락을 형성한다. 집락의 수는 시료에 있는 살아있는 개체 수와 같으므로 이 방법으로 미생물 집단에서의 개체수를 계산할 수 있다.나. 획선평판법 (Streak-plate)이 방법은 접종액의 세균수를 줄여 배지에 집락이 분산되도록 하는 데 가장 많이 이용하는 방법이다. 먼저 시험균액 1백금루프량을 평판 한쪽에 접종하고 한쪽에 골고루 바른다. 백금루프를 알콜램5H5OH)이다. 이 에탄올은 삼투능력이 커서 세균 표면의 막을 잘 뚫고 들어간다. 에탄올이 세균 막을 뚫고 들어가 세균의 단백질을 응고시켜 죽이는 것이다. 그런데 100% 에탄올은 단백질을 응고시키는 능력이 너무 탁월해 세균 표면의 단백질을 한꺼번에 응고시켜 단단한 막을 만들어버리기 때문에 오히려 에탄올이 세균 내부의 단백질까지 침투하지 못한다. 따라서 살균 작용을 효과적으로 일어나게 하려면 100% 에탄올에 물을 섞어서 농도를 떨어뜨려야 한다. 70~75%의 에탄올이 가장 살균 효과가 높은 것으로 알려져 있다.5. Centrifuge(원심분리기)부유물이 있는 현탁액을 가만히 두면 밀도가 높은 물질은 중력의 영향으로 서서히 바닥으로 가라않고 밀도가 낮은 물질은 서서히 상층부로 이동하게 되는데 이런 과정을 침전이라 한다. 밀도차가 나는 물질이 섞이면 침전현상이 발생 하게 되고 시간이 지나면 혼합물을 밀도 차에 따라 분리해 낼 수 있다. (실제로 침전의 원리를 이용하여 폐수 정화시설에서 부유물과, 침전물을 분리하고 있다.) 혼합물끼리 밀도 차는 혼합물을 분리해주는 힘인 중력이 강해질수록 커지므로 인위적으로 중력을 크게 해주면 침전현상을 가속할 수 있다.중력대신 원심력을 이용하면 쉽게 침전현상을 가속시킬 수 있는데 이런 과정을 원심분리라 한다. 원심분리기는 원심분리의 원리를 이용해 성분이나 비중이 다른 물질을 분리 ·정제 ·농축하는데 쓰이는 기계이다.원심분리기는 사용목적에 따라 의료용, 폐수 처리용, 우라늄농축용, 생산용, 실험용으로 분리될 수 있다.+의료용 원심분리기 : 혈액, 뇨, 타액 등의 분석을 위해 구성성분의 분리를 목적으로 사용한다.+폐수처리용 원심분리기 : 환경오염 방지를 위해 폐수에서 미립자를 고형화 시켜 슬러지의 형태로 분리해내거나 유류오염물질을 분리시키기 위해 사용한다.+우라늄 농축용 원심분리기 : 핵무기의 원료인 농축우라늄235를 얻기 위한 원심분리기이 다. 우라늄을 기체화 한 후 원심분리하면 우라늄 235와 238을 분리해낼 수 있다.+생산용가격이 경제적이다. 따라서 편차원심분리는 실험실이나 산업현장에서 세포의 회수에 일반적으로 많이 이용되고 있다. 예를 들면, 크기가 다른 E. coli (0.5 ㎛)와 D. discoideum (10 ㎛)의 분리와 같은 경우에 효율적으로 이용될 수 있다.2) 밀도 기울기 원심분리밀도 기울기 원심분리에서는 편차원심분리 경우와 다르게 균질 용액 대신에 밀도기울기를 이용한다. 용액의 밀도는 튜브 아래로 내려갈수록 증가하기 때문에 원심분리 중의 대류(convection)에 의한 혼합을 방지할 수 있다. 밀도기울기 원심분리에는 속도침강원심분리와 등밀도 원심분리의 두 가지 형태가 있다.?.속도침강 원심분리 (rate-zonal centrifugation)속도침강 원심분리는 밀도기울기(density gradient)를 이용한 방법으로 크기가 다른 입자가 동시에 침전하는 문제점을 극복할 수 있으므로 크기가 확실한 단백질, RNA, 리보좀(ribosome) 등의 분리에 이상적으로 활용할 수 있다그러나 세포막 단편, 세포내 소기관 등은 분리하기 힘들다. 이 방법의 이용 시에 주의할점은 시료를 넣을 때 밀도기울기 매질의 가장 윗면으로 매질과 섞이지 않도록 조심하여주입(loading)해야 한다는 것이다. 또한 원심분리시에도 저속에서 시간을 짧게 실시하여야 하며 그렇지 않으면 모든 입자가 바닥에 가라앉게 된다. 또한 밀도기울기 원심분리는분리하고자 하는 시료의 형태에 따른 입자의 분리에는 적합하지 않다.b.등밀도 원심분리 (isopycnic centrifugation)등밀도 원심분리는 밀도에 기초하여 입자를 순수하게 분리하는 방법으로 입자의 크기는입자의 등밀도 위치에 도달하는 속도에만 영향을 준다. 이 방법의 특징은 입자가 등밀도위치에 존재하기 때문에 고속으로 오랜시간 동안 원심분리하여도 입자에 아무런 영향을주지 않으며 바닥에 가라앉지도 않는다. 또한 시료를 주입(loading)할 때 매질과 섞이어도 분리에는 아무런 영향을 주지 않는다. 밀도기울기의 형성은 매질에 따라 만들어서 넣어 주), 새우, 바닷가재 등 고급식품의 선도유지 및 장기 보관하는 수산 또는 식품산업이나 철강의 Sub-Zero처리 및 Interference Fit(억지 끼워맞춤), 공업용의 저온냉각장치나 액화질소에 의한 냉각기의 대체장치 등 일반 산업분야에까지 두루 쓰이고 있다. 장기안정 보존을 실현한 -150'C에서부터 정도가 높은 보존환경을 약속한 -130'C, 이용도가 대단히 높은 -95'C ~ -70'C의 초저온 냉동고는 여러 가지의 온도대와 다양한 내 용적을 갖추고 있어 이용자의 사용목적에 따라 마음대로 선택할 수 있게 되어있다.보통 초저온 냉동고는 오래전부터 지구환경보호를 위해 NON-CFC계 냉매를 사용한다9. 배지의 종류배지는 이용되는 재료, 사용형태, 사용목적 등에 따라 다음과 같이 분류한다.가. 재료에 따른 분류1) 천연배지 : 배지재료가 천연물로서 그의 화학조성이 확실히 알려져 있지 않은 배지를 천연배지라한다. 감자한천, Oat meal 배지, 볏짚 배지, Nutrient broth 배지 등이 있다.2) 합성배지 : 화학조상이 알려져 있는 재료만으로 만들어진 배지로서 Czapek-Dox 배지 등이 있다.3) 반합성배지 : 합성배지 성분의 일부를 peptone, yeast extrack 등 화학조성이 밝혀지지 않은 천연물로 바꾸어 놓은 배지이다나. 사용형태에 의한 분류1) 액체배지/고체배지 ; 액체배지(liquid medium)에 한천, 젤라틴 혹은 실리카겔 등을 첨가하여 굳힌 것이 고체배지(solid medium)이다. 액체배지는 미생물의 생리 및 화학적 연구 혹은 미생물의 대량 배양에 사용되며, 고체배지는 미생물의 보존배양, 순수 분리 등에 사용된다. 고체배지에는 평판배지, 고층배지, 사면배지 등이 있으며, 목적에 따라 사용방법이 다르다. 한천 등 고형제의 함량은 사용목적에 따라 바뀐다.다. 사용목적에 의한 분류1) 보통배지 : 보통배지는 될 수 있는 한 많은 미생물이 생육할 수 있도록 제조된 배지로서 세균용으로는 Nutrient broth, NutrieO4) 1g, 황산마그네슘(MgSO4·7H2O) 0.5g, 염화칼륨(KCl) 0.5g, 황산철(FeSO4·7H2O) 0.01g, 포도당 30g, 증류수 1000ml[실험방법]증류수 1000ml에 위의 재료를 넣고 끓여서 잘 녹이고, 121℃에서 15분간 고압 살균한다.4. 실험방법1일째1. 10-2의 희석액을 각각 10-6 ,10-7, 10-8 로 희석한다.2. 희석액 (5,6,7,8)을 150㎕ 채취하여 배지에 도포 시키고 도말 평판법(spreading)을 시행 한다.3. 배지에 도포한 배양액이 다 마르면 뒤집어서 37℃ incubator에 배양한다.4. 16시간 후에 균을 관찰 한다.2일째1. 16시간 37℃, incubator에서 배양한 균을 확인하고 서로 colony가 모양이 다른 것을이쑤시개로 균을 채취한다.2. 이쑤시개를 TSB 액상배지에 접종하고 16시간 shaking incubator에서 배양한다.3일째1. TSB 액상배지에 배양한 균을 각각 백금이에 묻혀 배지에 Streaking을 한다.2. Streaking한 배지를 인큐베이터에 16시간 37℃ 배양을 한다.3. 배양을 다하고 나면 각각의 균이 제대로 분리가 되어있는지 확인을 한다.Stock 제조 과정1. 균1, 균2, 균3(총 6개)을 1mL씩 1.5ml micro tube 첨가한 것을 centrifuge (8000rpm,4℃, 5분)한다2. Centrifuge한 것을 그림2 와 같이 배양액을 버린다.3. 배양액을 버리고 10% glycerol 1ml을 넣고 현탁 시킨다.4. Deep-freezer (초저온 냉동고)에 보관한다.소독 시 왜 70% 알코올을 사용하는가?5. 시약 및 실험기구-CulturesE.coli(Escherichia coli), Bacillus subtilis, Enterococcus faecalis가 있는 토양.-MediaTSB 액상배지Tryptic Soy Broth 만드는 법- 증류수 1L + Tryptic Soy Broth 30g 희석 시킴- 10% Nacl 만드는 다.

자연과학| 2011.10.06| 20페이지| 3,000원| 조회(466)

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