1. title : Isolation of Plasmids (pET15bm)-Protocol 1. Miniprep: 알칼리 세포파괴 방법에 의한 플라스미드 DNA의 분리2. AbstractAlkaline lysis 방법은 세균 세포를 먼저 SDS(이온성 계면활성제 및 단백질 변성제: 세포막의 지질 성분을 용해시켜 세포막 파괴) 및 NaOH (alkali)로 처리하여 세균 세포를 부수는 동시에 DNA 염기쌍의 수소결합을 파괴하여 이중나선 구조를 분리시킨다. 이어서 산성 용액(potassium acetate)을 가하여 중화시키면, 염색체 DNA는 크기가 너무 커서 변성 전의 정상의 상태로 복원되지 못하고 더욱 엉키게 된다. 염색체 DNA와 단백질은 potassium과 SDS간에 형성되는 complex 속에 갇혀 흰색의 침전물로 가라앉는다. 반면 크기가 작고 공유결합으로 연결되어 있는 supercoiled plasmid DNA는 정상적으로 복원이 되어 용액에 녹아 상등액에 남게 된다. 이 방법은 plasmid DNA와 염색체 DNA간의 구조적 차이에 기인하여 plasmid DNA만을 분리하는 방법이다.3. Principle⑴ What is the Plasmid ?플라스미드란 세포 내에서 발견되는 염색체 외의 이중가닥 DNA로서 독립적 복제 능력을 가지는 유전인자들의 집합체이며 염기쌍의 수가 수천에서부터 수십만까지 그 크기가 다양하다. 주로 항생물질에 대한 저항성을 나타내는 유전자를 포함하고 있다. 대부분 환형 분자이나 일부 박테리아는 선형 플라스미드를 가지고 있고, 그람양성 박테리아의 플라스미드는 정상적인 복제과정과는 다소 다른 회전환 복제과정을 거치기 때문에 단일가닥 DNA가 많이 생기게 된다. 복사본수(copy number)는 플라스미드마다 다르고 박테리아 세포는 한 종류 이상의 플라스미드도 가질 수 있다. 예를 들면, 세포 하나가 두 가지 다른 유형의 플라스미드를 가질 수 있는데, 한 플라스미드는 복사본이 수백 개이지만 다른 유형은 복사본이 단지 한 개뿐일 수는 세포 내 단백질들은 proteinase K에 의해 분해되고 분해된 단백질들은 phenol과 chloroform을 처리함으로써 제거할 수 있다.⑶ How do you break the cell membranes ?? 용액 상태로 분리하는 방법 : lysozyme을 처리해 세포벽을 분해시킨 뒤 세첵제인 SDS를 이용하여 세포막을 분해시킨다. EDTA는 효소 활성에 필요한 Mg2+과 착염을 형성하기 때문에 효소의 작용을 억제할 수 있다. 다만 용액상태라서 각 단계의 처리과정 중의 시료의 손실이 매번 다르기 때문에 항상 균일하게 DNA를 회수하기는 어렵다.? 고체 상태로 분리하는 방법 : 손실의 차이를 최소화하기 위한 방법으로 박테리아 세포들을 녹는점이 낮은 한천 겔에 균일하게 고정시킨다. 효소들이 한천 겔을 통과할 수 있으므로 이 상태에서 세포막과 단백질을 분해시키며, 분해된 세포막과 단백질들은 세척 과정을 통해 제거된다. 그 결과 DNA만이 한천 겔에 남게 된다.⑷ What is the role of ethanol in the current experiment?알코올에 의한 침전으로 DNA를 얻을 수 있다. Alkaline lysis법에서 S3-buffer를 넣고 원심 분리하여 얻은 맑은 상층액을 새로운 튜브에 옮긴 후 2~2.5배 volume의 에탄올을 넣는다. 물은 DNA보다 에탄올과 더 결합하려는 성질이 강하여 DNA분자로부터 떨어져 나와 에탄올과 반응하게 됨으로 홀로 남은 DNA는 침전하게 된다. 이 후 원심분리법으로 침전된 DNA를 회수한다.⑸ How do you determine the concentration of the plasmid isolated using UV/Vis spectrometry?퓨린 및 피리미딘 염기의 공명구조 때문에 핵산, 뉴클레오티드 등은 UV에서 260nm 파장영역을 가장 많이 흡수한다. 염기들은 각각 개별적인 자외선 흡수 영역을 가지며 핵산의 총 흡광도는 이러한 염기들 각각의 흡광도를 합한 것과 같다고 생각할 수 있다. -buffer(Neutralization Buffer): 4.2 M Gu-HCl, 0.9 M potassium acetate, PH4.8? AW-buffer (binding Buffer): 5 M Gu-HCl, 30% isopropanol⑤ PW-buffer (Wash Buffer): 10 mM Tris-HCl pH 7.5, 80% ethanol Store at RT⑥ ddH2O(sterile)시약명특성S1-BufferTris-ClTris buffer는 phosphate buffer보다도 더 많이 쓰이는 buffer로서 물에 잘 녹는다. 사용하려고 하는 pH를 HCl의 첨가로 Tris-Cl의 형태로 사용하며 보통 pH 8.0짜리를 사용한다. Tris는 생화학적 반응에 대해 안정적이고 칼슘이온에 의해서 침전이 일어나지 않는다는 장점이 있다. 다만 다른 buffer들에 비해 온도의 변화에 민감하여 pH의 변화가 생기며 상온과 4도씨에서와 pH의 차이가 많이 난다.EDTA4개의 카복실산염과 2개의 아민기를 매개로 하여 금속과 결합하는 무색의 결정성 가루이다. 거의 모든 금속이온과 수용성 킬레이트를 만드는 특징을 갖고 있어 분석화학의 널리 응용되고 있다. EDTA는 네 개의 acetate로 2가 양이온을 잡아주는 역할을 한다. 일반적으로 미생물의 EPS 사이를 안정화 시키는 Mg2+와 결합하여 세포벽을 약하게 만드는 역할을 하며, DNase와 RNase의 활성을 막는 역할도 한다.S2-BufferNaOHNaOH는 pH를 12.0~12.5로 만들어, 염색체 DNA와 단백질, plasmid DNA 등을 변성시킨다.1% SDSSDS는 일종의 계면활성제로서 세포막의 지질 등을 녹여 세포를 용해시키고, SDS용액에 단백질을 넣고 끓이면 단백질의 3차구조가 파괴되어 변성된다. 이때 SDS분자의 긴 소수성 꼬리가 단백질의 골격을 감싸면서 음전하를 띈 꼬리의 끝부분을 밖으로 향하게 된다. 따라서 단백질의 아미노산 조성에 상관없이 모두 음전하를 띄게 된다.단백질을 이루는 아미노산은 라앉아서 pellet을 형성한다. DNA와 너무 오래 반응하면 DNA의 질이 떨어지므로 주의해야 한다.80% EtOH실험과정 중에 투입된 시약들이나 불순물을 제거하는 역할을 한다. DNA의 수분도 제거해주며 DNA를 응축된 상태로 유지시켜준다.⑵ Method1. Alkaline Lysis? 밤새도록 배양한 세포 배양액(7.5 mL)이 담긴 50 ml tube를 4,000 rpm에서 10 분 동 안 원심분리한 후 상층액은 버리고, 깨끗한 티슈 위에 뒤집어서 1 분간 방치하여, 상층액 을 완전히 제거한다(이 때 튜브를 테이블에 가볍게 두드려 상층액을 제거하여도 됨).? 50ml tube에 250 μl 의 S1-buffer를 넣고 pipette을 up&down 하여 가라앉은 대장균 세포를 분산시킨다.? 분산된 세포현탁액을 1.5 ml eppendorf tube(ep tube)에 옮긴다.? 250 μl의 S2-buffer를 첨가하고 뚜껑을 닫은 뒤, 조심스럽게 6~8번 위, 아래로 섞는다. (절대 vortexing 하지 않으며, 5분 이상 경과되어서는 안 됨.)? 350 μl의 S3-buffer를 넣고 뚜껑을 닫고, 바로 6~8번 위, 아래로 섞는다, 13,500 rpm 에서 10분간 원심분리한다. 원심분리를 기다리는 동안 DNA회수용 spin column을 준비한 다. (본인의 것을 구별하기 위해 네임펜으로 표시한다).? 가라앉은 침전을 피해, 맑은 상층액 만을 피펫으로 수거하여 spin column에 넣는다.? spin column을 13,500 rpm에서 1분간 원심분리한 뒤 하단의 여과액은 버린다.? spin column에 500 μl의 AW-buffer를 넣고 13,500 rpm에서 1분간 원심분리 한 후, 여과액은 버린다.? spin column에 700 μl의 PW-buffer를 넣고 13,500 rpm에서 1분간 원심분리 한 후, 여과액은 버린다.? spin column을 한 번 더 13,500 rpm에서 1분간 원심분리하여, PW-buffer를 완전히했던 cuvette을 잘 세척하고, 건조시킨다. (Cuvette는 약 20만원 상당의 고가 제품이므로, 파손에 주의한다)* Nanodrop(4층 중앙기기실에 구비되어 있음)을 이용한 측정.① Nanodrop에 연결되어 있는 컴퓨터를 부팅시킨다.② 바탕화면의 Nanodrop icon을 더블 클릭하여 프로그램을 시동하고, Nucleic acid를선택한다.③ 자동 진단 질문에 ok를 클릭하고 기다린다. 진단이 종료되면, 메뉴 상단 오른쪽의DNA 메뉴를 선택한다.④ Blank 테스트를 위해 컴퓨터 오른편에 있는 Nadodrop을 커버를 열고, Kimwipes로Nanodrop의 상단과 하단의 접점 부분을 닦아내고, Nanodrop 하단 접점에 1.5 μl의ddH2O를 로딩한 후, 커버를 닫는다.⑤ 메뉴 상단 왼쪽의 Blank를 클릭하고, blank test가 종료될 때까지 대기한다.⑥ Blank test가 종료되면, 커버를 열고 Kimwipes로 증류수를 제거한 후, 측정 시료(DNA 용액) 1.5 μl를 로딩한다.⑦ 메뉴 상단 왼쪽의 measure를 클릭하면, 측정을 시행한다(measure를 2-3회 정도클릭하여 측정값을 확인함).⑧ 측정을 마치면, Nanodrop 커버를 열고, 상/하단 접점을 Kimwipes로 닦아 측정 시료를 제거한 후, 커버를 닫고 프로그램과 컴퓨터를 종료시킨다.5.Result(1) 농도계산식 : DNA 농도(μg/ml) = A260값 x 50(μg/ml) x 희석배수(2) 측정된 DNA 농도: 20.7 ng/μl(3) 흡광도 : A260 = 0.415A280 = 0.233(4) 측정된 DNA 순도: A260/A280 = 1.78A260/A230 = 1.696.Discussion(1) DNA 농도? DNA 농도의 결정: 260nm에서 흡광도 또는 Optical Density를 측정하여 결정한다. 정 확한 측정을 위하여 A260값은 0.1~1.0 사이 범위에서 측정되는 것이 좋으며, 이를 위하여 필요에 따라 측정될 DNA를 적절하게 희석하여 흡광한다.
