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고려대학교 생명계열 편입학 최종합격 자소서

1. 해당 모집단위 지원 동기 및 졸업 후의 진로와 계획을 기술하시오.2. 본인의 가치관을 기술하고 그 가치관을 형성하는데 중요했던 경험과 성장과정을 기술하시오.3. 학업이외 대학시절의 중요한 활동과 결과를 기술하고, 그 경험이 지원전공을 공부하는데 어떤 의미를 갖는지 기술하시오.4. 입학 후 학습목표 및 학업계획을 기술하시오.1. 해당 모집단위 지원 동기 및 졸업 후의 진로와 계획을 기술하시오.제가 공부한 다양한 생물전공 중에서도, 가장 관심을 가진 분야는 세포 신호 전달 과정과 관련된 세포예정사(apoptosis)입니다. 세포 자체의 내재된 프로그램에 의해 세포가 사멸되는 과정으로, 일반적으로 생체의 유리한 방향으로 진행되는 과정이 저에게 ‘아주 정교하게 설계된 톱니바퀴’ 같은 인상을 주었습니다. 스스로 세포예정사를 공부하면서, 고작 2년 학부 과정 동안 배운 지식과 경험이 세포예정사를 이해하는데 턱없이 모자란 것은 당연한 것이었지만, 조금이라도 더 많이 알 수 있는 기회가 있다면 좋겠다 라는 생각이 들었습니다. 현재 제가 속한 대학에 분자생물학, 생화학 강의가 있지만, 이외에는 세포예정사와 관련된 다른 강의는 없습니다. 또한 제가 속한 대학은 생물화학공학, 생물공정공학 등에 초점을 맞춰서 미생물과 동물, 식물세포를 생명공학에 어떻게 이용하는지 혹은 reactor를 공정에 어떻게 이용하는지 등 회사의 직무와 연관된 것들을 더 배우는 것 같습니다.그리하여 본격적으로 편입에 관심을 가지고 알아보던 중 고려대학교 학부생이 세포 신호 전달 경로 단백질을 조절하는 물질을 발견해 전립선 암 세포 증식을 억제하는 물질을 발견했다는 기사를 보게 되었습니다. 무척 흥미 있게 기사를 읽었고 계속해서 고려대학교에 대한 정보를 찾아보게 되었습니다. 고려대학교에서 개설하는 동물생리학, 동물분자육종학, 분자 바이러스생명공학, 의약에 기초가 되는 식물공학, 면역공학 등 굉장히 기대가 되는 과목들을 보며, 이곳의 훌륭한 교수님들 밑에서 전문적인 공부를 하고 싶다는 꿈을 가지게 되었습니다.대학졸업 후에는 교수님들께 배운 전공지식과 연구실에서 배운 실험지식을 발판으로 세포예정사에 관한 신호전달계를 더 구체적으로 밝혀내고, 암 뿐만 아니라 신호전달계와 관련된 질병의 병인을 이해하는데 이바지 할 것입니다. 이러한 꾸준한 연구를 통하여 고부가가치인 의약개발 및 한국의 생명공학 분야 기술발전에 크게 기여하고 싶습니다.2. 본인의 가치관을 기술하고 그 가치관을 형성하는데 중요했던 경험과 성장과정을 기술하시오.‘천천히, 하지만 끝까지’ 하나의 목표를 향한 끊임없는 질주. 저는 고등학생때 목표와 관심있는 분야가 없었습니다. 남들 다 준비하는 대학 입시와 주위에서 들리는 말로 목표도 관심있는 분야도 없이 ‘그냥 남들 다 하니까’ 라는 생각으로 공부 했습니다. 하지만 열심히 하지 않은 저는 단지 수능 성적에 맞춰, 흥미도 없는 학과에 입학을 했습니다. 대학교에 입학 후 새로운 만남으로 설렘도 있었지만, 당시에는 알 수 없는 불안감이 구석에 자리 잡았습니다. 학교를 다니면 다닐수록 ‘이 분야를 탐구하며 즐길 수 있겠다.‘ 라는 생각이 들지 않았습니다. 그래서 한 학기를 다니고 휴학하여 시간을 보내다 입대를 했습니다. 현역으로 군 복무 중에, 잡지를 읽다가 바이오라는 주제에 굉장히 큰 매력과 재미를 느꼈습니다. 저는 굉장히 매력적으로 다가온 생명공학으로 진학을 결심했고, 처음으로 세운 큰 목표를 위해 군 복무 중에 수능을 다시 공부했습니다. 하지만 복무 중에는 공부할 수 있는 시간이 적었고, 주위로부터의 비난도 받았습니다. 심리적으로 힘들어 밤에 혼자 울기도 했고 탈모도 왔었지만, 생명공학이라는 목표를 위해 꾸준히 나아갔습니다. 결국 휴가를 사용해 수능을 응시하였고, 정시로 생명공학부에 입학을 하였습니다. 처음으로 노력의 가치를 알았고 작지 않은 성공을 경험 했습니다.복무 중에 제가 수능공부를 할 수 있었던 원동력은, 입시를 준비하며 생긴 ‘천천히, 하지만 끝까지’ 라는 생각 덕분이었습니다. 저만의 신조를 기억하면서, 주어진 목표에 대해서는 어떤 상황 변화가 있더라도 반드시 달성하려고 노력하는 모습을 유지할 수 있었습니다. 이런 저의 가치관은 대학생활에서도 유지됐습니다. 비록 이런 장점이 시간 지체라는 단점으로 나타나기도 하지만, 항상 세밀한 추진 계획을 세우면서 일을 진행함으로써 단점이 아니라 장점으로 승화시켜 나가고 있습니다. 이런 저만의 모습이 앞으로 작은 부분까지 세밀하게 고려하고 끊임없이 반복 실험해 나가야 하는 생명공학 분야에 가장 적합하다고 자신합니다.3. 학업이외 대학시절의 중요한 활동과 결과를 기술하고, 그 경험이 지원전공을 공부하는데 어떤 의미를 갖는지 기술하시오.저는 담임 교수님의 주도로, 교수친화 활동에 참여 했습니다. 활동에 참여하면서, 콜라겐을 분해해 피부로 흡수시키는 방법에 대한 연구에 참여 하였고 여러 논문발표도 들었던 적이 있습니다. 논문발표를 집중해 들었지만 용어, 왜 이런 실험법을 사용했는지에 대해 의문점을 많았고 이를 해결하기 위해 생물학관련 가장 저명한 책을 구매하여 스스로 읽기 시작하였습니다. 생화학, 세포생물학, 분자생물학, 생리학 등의 큰 구분 없이 이해를 돕기 위한 챕터 구성으로 생물학의 전반적인 흐름과 단원간 연관관계를 알 수 있었습니다. 책을 읽으며 ‘재미있다.’ 라는 느낌을 받았습니다.저는 교육 봉사활동을 했습니다. 저소득층이나 다문화가정의 청소년들에게 생물학 교육봉사와 대학 강의 체험을 제공했고, 아이들과 간담회를 열어 여러 생물학적 아이디어를 듣는 시간을 꾸준히 가졌습니다. 1년동안 166시간 이상의 봉사시간을 인정 받았습니다. 봉사활동을 하면서 나에게는 특별한 경험이 아닌 일이, 누군가에게는 하고 싶어도 못하는 특별한 경험이라는 것을 알았습니다. 이곳의 아이들은 저소득층이나 다문화 가정으로, 사회의 구성원으로서 조금은 거리가 멀었습니다. 이들은 어려운 상황이었지만 저희보다 더 활발한 성격과 환한 미소를 지니고 있는 모습들을 보면서 저만의 나태함을 반성할 수 있었습니다. 이를 바탕으로 학업에 더 매진할 수 있었습니다.바이오 시밀러 회사에서 파트타이머로 근무를 한 적이 있습니다. 제가 있던 부서는 해외 식약청에 품질 심사를 받는 업무를 맡고 있던 팀입니다. 저는 이 부서에서 문서 정리와 심사관이 추가 문서를 요청하면 찾아 전달하는 역할을 맡았습니다. 역할을 수행하면서 중요하다고 느꼈던 것은 생물학과 관련된 기본 용어를 아는 것과 영어회화였습니다. 심사 현장을 보며 종종 대화를 이해하지 못했고, 심사관이 쉬는 시간에 장난 섞인 말을 걸어온 적이 있지만 대답을 잘 하지 못했습니다. 저는 현재 생명공학 뿐 아니라 영어회화에도 욕심을 가지고 있습니다.4. 입학 후 학습목표 및 학업계획을 기술하시오.적극적인 태도로 임하기. 주어진 교재나 강의 뿐만 아니라 보다 다양한 책자, 논문 등을 활용하여 보다 깊이 있는 전문지식과, 이론을 한 단계 더 응용할 수 있는 실무 능력을 극대화하는데 집중할 것입니다. 지금까지 성실과 근면을 기초로 의미 있는 학습을 해왔기 때문에 앞으로도 이런 장점을 꾸준히 유지함으로써 노력하는 자세를 유지할 것입니다. 그래서 학기 중에는 학교에서 배운 과목을 단지 시험을 위한 단순 암기가 아닌, 정말 이해하려고 노력할 것입니다. 먼저 편입 후에는 낯선 환경에 빠르게 적응하기 위해서 한 걸음 더 빠르게 다가가는 노력들을 반복할 것이며, 생명공학을 비롯하여 컴퓨터 코딩이나 인문학 등을 수강하면서 생명공학에 대한 보다 깊이 있는 학습에 매진할 것입니다. 필요하다면 저학년 과정을 청강하면서 보다 튼튼한 기초를 확인해 나갈 것입니다. 4학년이 되면, 실습과 실험법을 중심으로 기존의 배운 지식들을 응용하는 노력들을 반복할 것이며, 학과내 연구실에 들어가 보다 다양한 실험과 프로젝트를 진행하면서 남다른 학습 성과를 만들어가고 싶습니다. 그리고 이런 노력들을 마냥 맹목적으로 하는 것이 아니라, 저만의 정리 보고서를 만들어가면서 깊이 있는 지식으로 소화할 것입니다.다양한 경험을 통한 나만의 색깔 만들기. 주어진 전공 공부 이외에 다양한 경험을 하면서 책에서 배울 수 없는 소중한 교훈들을 제 것으로 만들 것입니다. 항상 다른 사람의 입장에 서서 배려하고 양보하는 유연한 사고방식을 기초로 사회적 약자에게 힘이 되어주는 봉사활동 뿐만 아니라 다양한 과외활동들을 전개하면서 보다 차별적인 시각을 체득할 것입니다. 각각의 활동에 대한 강한 동기의식을 부여하여 보다 집중할 수 있는 강한 집중력을 체계적으로 제 것으로 완성할 것입니다. 그리고 생명공학 분야 뿐만 아니라 리더십에 대한 강의를 폭넓게 수강하면서 하나의 분야 전문가의 편협한 모습이 아니라 전체를 포괄적으로 분석하고 앞에서 바라볼 수 있는 리더의 모습을 체계적으로 준비해 나갈 것입니다.

학교| 2023.05.22| 5페이지| 30,000원| 조회(164)

고려대, 고려대학교, 편입학, 생명과학부, 생명공학부

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고대 전공생이 쉽게 쓴, 코로나바이러스(covid)의 대하여.

코로나 바이러스에 대한 기본적인 내용전 세계가 Corona virus로 인해 지독한 몸살을 앓고 있다. 2019년 중국의 우한에서 처음 발생한 이후, 전 세계 각국으로 빠른 속도로 번지고 있다. 코로나는 초반에는 원인 불명의 호흡기 질환으로 분류 되었으나, 2020년 1월 9일 세계보건기구(WHO)에 의해서 Corona virus로 밝혀 지면서 국내에서는 코로나19, 해외에서는 COVID19라는 명칭으로 사용되고 있다. 해외에서 불리는 COVID 라는 명칭에서 CO는 Corona의 앞 두 글자, 그리고 Virus의 VI, 그리고 질병이라는 뜻의 Disease의 D가 결합되어 만들어진 용어이며, 초기에 ‘우한폐렴’ 이라고 불리던 것을 세계보건기구의 권고에 따라 COVID 19으로 공식 명명 되었다. 코로나19는 새로운 질병이며, 아직도 전 세계는 이 바이러스가 정확히 어떠한 방식으로 지금과 같이 빠른 속도로 퍼지고 있는지를 연구하는 중에 있다.Corona virus는 사람과 동물에 감염될 수 있는 virus이다. 이를 zoonotic virus라 하며, 동물매개로 인해 propagation이 일어난다. genome이 RNA이고, envelop을 가지므로 enveloped RNA virus이다. 게다가 envelop surface에 spike가 나 있고 RNA virus 중 가장 크다고 할 수 있다. 현미경으로 확대했을 때 입자표면에 곤봉모양의 spike들이 관찰 되는데. 이것이 라틴어로 왕관을 뜻하는 코로나로 붙여 즉 코로나바이러스라 이름을 붙였다. [그림1.]을 보면 왕관모양을 쉽게 확인 할 수 있다.zoonotic virus는 여러 타입으로 분류가 가능하다. 요즘 들어 자주 일컫는 Corona virus는 염기서열 분석상 알파 베타 감마 델타로 분류된다. 감마와 델타는 주로 조류, 알파와 델타는 주로 박쥐나 포유류를 중심으로 전염되는 바이러스이다. 이중 사람에게 감염되는 바이러스는 두 개의 알파 코로나바이러스와 4개의 베타 코로나바이러스이다. 이중 베타 코로 수 있는 유전자 크기 27~32kb의 RNA 바이러스이다. virus는 단순히 핵산과 단백질로 이루어져 있기 때문에 숙주세포 외부에서 매우 약하다. 덥고 습한 환경에서는 단백질이 쉽게 변성되기 때문에 단백질이 잘 변성하지 않는 춥고 건조한 환경에서 잘 생존한다. 그래서 주로 추운 겨울에 유행하고 널리 퍼질 수 있다.SARS-CoV-2의 whole genome sequence 비교 분석을 통해 박쥐 유래의 코로나바이러스(Bat SARS-like coronavirus isolate bat-SL-CoVZC45)와 가장 높은 염기서열 상동성 (89.1%)을 보인다. 사람 코로나바이러스 4종과 상동성 39-43%, 메르스 코로나바이러스 50%, 사스 코로나바이러스 77%의 상동성이 확인되었다.SARS-CoV-2의 기존 숙주는 박쥐와 천산갑으로 추정된다. Zoonosis(인수공통) 바이러스 중 박쥐를 매개로 하는 바이러스들은 특히 강한 병원성을 가지게 되는데, 이는 박쥐가 비행할 때 다른 표유류들이 면역 반응할 때 정도의 고온으로 올라가기 때문이다. 그래서 박쥐의 고온조건에서 살아남은 바이러스들은 보다 강한 병원성을 가지게 되는 것이다. 이번 COVID-19도 여름이 되면 잠잠해질 것이라 예상하였었지만, 더운 나라에서도 전염병이 잘 퍼지는 등 고온 조건에 강한 특징을 보였다. 코로나 바이러스는 보통 몸에서 증식한 후, 증상이 나타나야 전염성을 가질 수 있게 되는데, COVID-19는 무증상 감염자도 존재한다는 것이 확인되었다. 무증상에서도 감염성을 가진다는 것이다. 마지막으로 RNA 바이러스이기 때문에 이번 유행기간동안 전파되면서 다양한 변이가 출몰하게 되었다. 이는 독감 바이러스인 influenza를 떠올리게 된다. Influenza처럼 앞으로 Corona virus도 매 계절마다 찾아보는 불청객이 될 수 있다고 생각된다.코로나 바이러스 발생과 전파 과정신종 Corona virus의 최초 감염 원인은 정확히 밝혀지진 않았지만 중국인들은 야생에서 서식하는 뱀이나 박쥐 전 유세 기간 중에 밀착 접촉이 많아 확진자가 급증한 것으로 보인다. 실제 대선 다음날인 4일 10만8554명을 기록한데 이어 5일에는 12만3718명, 6일에는 12만9634명으로 급격히 늘고 있다. 사망자도 24만명을 넘어서며 세계 1위를 기록했다.팬데믹(Pandemic) 이란, 특정 질병의 전 세계적인 발생을 일컫는다. 새로운 바이러스가 발생하게 되면, 이전에 존재하는 정보나 면역체계가 존재 하지 않으므로, 꽤 빠른 시일 내에 전 세계로 퍼질 수 있는 위험성이 있다. 2020년 3월 11일에 세계보건기구(WHO)가 코로나 19를 전 세계적 팬데믹(Pandemic) 으로 선언함에 따라 전 세계 경제가 요동쳤다. 팬데믹 현상은 1)인지 2)초기 3)가속 등 3단계로 각각 나뉘며, 국가별 혹은 지역별로 서로 각각 다른 단계로 나뉘게 된다. 일단 코로나의 팬데믹을 멈추는 방법은 간단하지만, 어렵다. 의심 증상이 있는 환자를 격리하고 치료하는 것이 가장 기본이다. 그리고 의심 증상을 가진 환자가 접촉했던 사람을 격리 시키고, 들렀던 장소를 폐쇄하는 것이 바로 그것이다. 코로나19는 잠복기가 최대 14일 정도이며, 무증상으로 급격히 증상이 악화되어 사망한 사망자들이 생긴 것으로 보아, 무증상인 감염자들도 상당수 있을 것으로 보이고 있다. 코로나에 감염됐던 사람들은 완치 후에도 타인을 감염시킬 위험이 있으므로, 완치 된 이후에도 최대 2주간 격리시키는 것이 안전하다고 설명한다백신 개발 현황현재 전 세계가 백신 개발로 전쟁 중이다. 하지만 아직까지 완벽한 백신 개발 소식은 들리지 않고 있다. 최근 백신이 나왔다는 뉴스를 본 적이 있는데, 아직 사용단계가 아니라고 한다. 사람에게 제대로 사용을 하려면 임상실험을 계속 진행해야 하며 나라의 승인도 거쳐야 한다. 즉 정확한 상용화 시기는 알 수 없다. 전문가들은 백신 개발이 왜 오래 걸리고 어려운지 다음과 같이 말한다. 첫째, RNA 계열 바이러스의 경우 변이가 잘 일어나기 때문에 백신 개발이 어렵다. 만약 백신을 개발한다고 품목 허가를 함으로써 당분간은 더 많은 코로나 19 국내환자 치료를 위해 사용될 것으로 예상된다.2) 혈장치료제전문가들은 단기간에 사용될 수 있는 코로나 19 치료제로서 혈장치료제에 기대를 걸고 있다. 실제로 전세계적으로 코로나 19 혈장치료제 개발을 위한 임상시험 신청이 크게 늘어나고 있다고 한다. 혈장치료제는 코로나 19 회복기에 있거나 완치된 환자의 혈액으로부터 혈장을 추출한 뒤 혈장에 존재하는 항체 면역글로블린을 농축하여 만든 치료제를 말한다. 항체는 코로나 19 바이러스에 달라붙어 바이러를 무력화시키고 옵시닌화 시켜, 우리 몸 속에 존재하는 면역세포가 코로나 19 바이러스를 공격할 수 있도록 만든다.국내에서는 신속한 개발을 위해 혈장치료제에 대한 임상 1 상 시험을 면제한 상황이다..3) 항체치료제혈장치료제 혈장의 항체를 쓴다는 개념이다. 하지만 항체치료제는 약간 개념이 다르다. 완치자들에게서 형성된 항체를 이용해 세포를 유전자 재조합시켜 대량생산화 하는 것이다. 완치자의 혈액에서 가장 우수한 효과를 보이는 항체를 선별하고 아미노산의 서열을 밝히고 post translational modification에 관한 분석을 한다.이후에 벡터에 정보를 넣어 yeast같은 진핵세포에 형질전환을 유도한다. 항체를 생산하는 세포를 만들고 최종적으로 그 항체를 가장 잘 생산하는 선별 배양해 항체를 대량생산해서 만드는 치료제이다. 항체치료제는 미국 제약사 일라이릴리가 6월 1일 세계 최초로 코로나 19 치료 목적으로 임상시험을 시 작하였습니다 . 또한 영국의 글락소스미스클라인와 미국의 리제네론 등 다른 업체들도 항체치료제 개발에 나서고 있고, 국내에서는 셀트리온이 항체치료제 개발에 나서고 있다.재감염 Reinfection과 재양성 Re-positive재양성은 재감염과 다르다. Re-positive는 환자 몸속에 남아있던 죽은 바이러스 조각이 RT-PCR(reverse transcription PCR) 검사에서 검출되거나, 음성 판정을 받을 때 바이러스양이 충분치 않8 segmented RNA (transcriptase +)를 갖는데, Antigenic variation는 이에 기인한다. influenza virus genome이 여러 조각으로 구성되어 있어서, 숙주세포에 2가지 이상의 different parent strains이 감염 시, 유전물질이 섞인다. 즉 genetic reassortment가 일어나 새로운 변종이 생긴다. [그림3.]을 참고하면 쉽게 이해가 가능하다. 따라서 한번 독감에 걸렸더라도 다음해 다시 걸릴 수 있다. 백신을 매년마다 새로 만들고, 새로 접종하는 이유이다.Corona virus19는 Influenza virus처럼 여러 가닥의 segmented RNA로 되어있진 않다. positive-sense single-stranded RNA로 되어 있지만, 지놈의 사이즈가 26 - 32 kilobases로 RNA viruses중 가장 크다고 할 수 있다. 길이가 긴 만큼 염기서열에 관한 돌연변이가 잘 일어날 수 있으며, 유사 종간 homologous recombination을 쉽게 예상할 수 있다. 우리는 Corona virus19를 더 연구 해야 하며, 그들의 정체를 밝혀내야 한다. Reinfection의 확률은 얼마인지, 증상이 더 심해지는지, 누구에게 더 위험한지 후속연구가 필요하다. 무엇보다 치료제보다는 근본적인 예방을 위한 백신을 만들기 위해, 바이러스의 어떤 life cycle을 막아야 하는지 결정할 필요가 있어 보인다. 이런 설명을 들으면 매년 늦가을에 유행하는 독감을 떠올릴 수 있다. 재감염의 의미를 생각해보면 코로나19가 보통 독감 바이러스와 유사한 패턴을 보일 수 있다는 뜻이다이런 현상은 Corona virus19에 의한 호흡기 질환들이, 감기나 독감같이 흔한 질병이 될 수 있음을 시사하는 바가 아닐까 생각된다. 감기를 약한 증상, 독감은 강한 증상이라고 받아들이는 것처럼 Corona virus19에 의한 증상도 이와 비슷한 양상을 보일 가능성이 높다고 생각된다. 전에 방역당국에ol

자연과학| 2020.11.13| 13페이지| 3,000원| 조회(291)

백신, 예측, 특징, 코로나, 치료제, COVID19

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생명공학실험. 순수분리streaking, 연속희석, API 20NE ZYM test

생명공학실험14주차AbstractComplex medium중 하나인 LB배지를 이용하여 순수분리 하는 실험을 하였다. Streaking을 이용해 Agar plate위에 점차적으로 희석시켜, 오염되지 않은 single colony를 관찰하였다. 또한 미생물의 밀도를 측정하기 위해, 연속희석법을 이용하여 10-6까지 희석 후 콜로니의 수를 측정해 생균수를 계산하였다. 하지만 10-6까지 희석하였지만 콜로니 수가 300을 초과하였다. 더 희석할 필요가 있었지만, 위의 자료를 이용하여 시료의 밀도를 구했다. 다음 실험은 API20NE이다. API20NE은 미지의 non-Enterobacteriaceae를 동정하는 실험이지만 특정 미생물을 이용하여 결과를 확인하였다. 또한 API ZYM을 이용하여 특정 미생물의 효소활성(효소의 존재여부)을 확인하였다,Introduction① Luria-Bertani media : LB배지는 미생물 배양에 가장 일반적으로 쓰이는 배지로써 Luria-Bertani media의 준말이다. Agar의 유무에 따라 Liquid media 와 Solid media로 나뉜다. 보통 liquid media는 많은 양의 cell을 얻기 위하여 & solid media는 single colony를 얻기 위해 사용한다. 이번 실험은 순수분리를 하기위한 실험이므로 고체 배지인 LB Agar Plate를 사용하였다. LB배지 성분은 다음과 같다.1.0%(w/v)Tryptone : 필수aa/ 0.5%Yeast extract : 비타민,금속이온/ 0.5%Nacl : Na+이온제공추가) Complex medium : 뷔페 느낌의 배지이다. 천연재료를 혼합하여, 미생물의 증식에 충분한 영양소를 함유하고 있어 제조하기 쉽다. 정확한 구성은 알 수 없다. 어쩌구 extract가 포함되면 그 배지는 복합배지. 이번 실험에 사용한 LB배지는 복합배지이다.② Streaking : 멸균한 백금이에 적당히 미생물 묻히고 transer시킨다. 굳은 아가배지 위에 일련의 평행하고 0^8 CFU/ml.보다 정확한 결과를 얻기 위해서는 실험을 2배 또는 3배수로 중복하여 실시한 다음 평균을 구한다. 이번 실험에서는 연속희석법과 순수분리법 중 하나인 Spreading을 이용하여 생균수를 측정한다.④ API 20NE TEST : Enterobacteriaceae에 속하지 않는 그람음성간균을 동정하는데 사용된다. 동정에 이용되는 8가지 생화학시험과 12개 종류의 탄수화물 동화시험법 등 모두 20가지 시험으로 구성되어 있다. 8가지 방법(생화학 테스트)은 saline용액에 시험균을 현탁하여 건조된 배지가 들어있는 키트의 큐플에 접종하여 배양 후, 발색시약을 첨가하여 물질의 대사유무를 색으로 판정한다. 12가지 동화시험은 12개 탄수화물이 유일한 탄소원으로 들어있는 키트 큐플에 접종배양 후 시험균이 이들 당을 이용할 수 있는지를 탁도 변화로 판정하는 방법이다. 이를 통해 동정용 소프트웨어로 미지의 미생물을 판독하지만 우리 실험은 미지의 미생물이 아니라 Chryseobacterium rhizosphaerae을 이용하여 결과를 관찰한다.⑤ API ZYM TEST : 미생물의 효소활성을 검사하기 위해 제작된 키트이다. 적은 양의 시료로 19가지 효소의 활성을 빠르고 조직적으로 검사가 가능하며, 각 well에는 기질과 완충액이 들어있어 반응을 용이하게 한다. 우리 실험은 Escherichia coli, Bacillus subtilis를 이용해서 효소활성(효소존재여부)를 판단하였다.Materials< Luria-Bertani(LB) Agar Plate >유산지, 시약수저, DW, 메스실린더, 삼각플라스크, 마그네틱바, 교반기, Petridish, 비커, 저울, Autoclave,1.0% Trytone, 0.5% Yeast extract, 0.5% Sodium chloride(Nacl), 1.5% Agar< Luria-Bertani(LB) Broth >1.0% Trytone, 0.5% Yeast extract, 0.5% Sodium chloride(Nacl)배양균액 1 ml+LB broth 9 ml : tube 1을 만들고 tube1에서 1ml를 따 LB broth9ml에 섞는다. 이를 튜브2. 위 과정을 적당히 희석될 만큼 반복한다(보통6회). 회석된 샘플에서 0.1ml를 LB agar plate에 spreading한다. 콜로니가 30-300개가 나오도록 희석배수 선택.< Determination of CFU >확산집락이 없고 콜로니수가 30-300개의 평판을 선택하여 집락수를 센다. 계수결과를 표로 정리하여 집락의 수가 너무 많을때에는 TNTC로 표시한다. 집락의 수가 30개 이하이면 TFTC로 표시. 3배수를 실시했으므로 집락수의 평균을 구하고 희석배율을 곱해 시료의 집락수를 구한다. 이에 부피를 고려하여 미생물 밀도를 구한다. 결과는 CFU/g 또는 CFU/㎖로 표시하고, 지수함수 형태로 표시하며, 유효숫자는 두 자리 또는 세 자리를 사용한다. 시료의 미생물 밀도 = 평균 집락수 x 희석배율 x 1/사용한 시료량(㎖)< API 20NE test >증류수를 tray에 붓고 끝에 균주의 정보를 기록해, 스트립을 위에 올려놓는다. NaCl 0.85% medium의 앰플을 열고 골고루 풀어지도록한다. 파스퇴르 피펫으로 배지에서 1~4개의 동일한 집락을 선택후 혼탁도를 0.5McFarland로 준비한다. NO3 에서 PNPG까지 생리식염수를 거품이 생기지 않게 튜브까지 채운다. AUX Medium을 개봉해 부유액에 남아 있는 200㎕를 앰플에 분주한다. GLU 에서 PAC 까지는 큐플과 튜브를 가득 채우고, GLU, ADH, URE 는 mineral oil로 큐플을 채운다. 호기적30℃, 2시간동안 배양 후 판독한다.< API ZYM test >증류수를 tray에 붓고 끝에 균주의 정보를 기록해, 스트립을 위에 올려놓는다. 스트립을 37℃, 4시간 배양 후 ZYM A와 ZYM B 시약을 큐플에 한 방울씩 떨궈 5분 후 반응결과를 판독한다.(판독표참고)Results① StreakingStreptococcus pyro직접 눈으로 생균수를 세는 것이 목적이다. 하지만 눈으로 세는 일이기에 너무 많은 콜로니가 모여 있으면 겹쳐보이고 세기 힘들다. 그렇기에 희석하여 30~300개의 콜로니 정도 만들도록 희석해준다. 본 실험에서는 10-6희석 후 평균 집락수가 365CFU이 나왔다. 시간이 없어 그대로 진행하였다. 처음에 미생물을 딸 때 너무 많은 수를 재취한 듯하다. 0.1ml에 대해 집락수가 365CFU가 나왔으므로 미생물 밀도는 3.65 * 109 (CFU/ml)이다. 우리실험은0.1ml를 사용했고, 밀도는 1ml기준이므로 평균집락수*배율*10을 해야한다.세번째 실험은 Enterobacteriaceae에 속하지 않는 그람음성간균을 동정하는데 사용되는 API 20NE이다. 하지만 본 실험에서는 미지의 미생물이 아닌 특정한 미생물을 넣고 결과만을 확인하였다. 조교님이 결과가 아주 잘 나왔다고 말씀해주셨다.네번째 실험은 효소의 존재여부(활성여부)를 판단하는 실험이다. well에는 기질이 들어있어 미생물에 기질과 반응하는 효소가 존재시, 반응한다. 실험결과를 보면 대장균은 2,3,4,6,7,8,9,11,12,14,15가 활성이었다. 판독표를 이용하면, 대장균은 Alkaline phosphatase, Esterase, Esterase lipase, leucine · valine · crystine aryamidase, Trypsin, Acid phosphatase, Naphtol-AS-BI-phosphohydrolase, 베타-galactosidase, 베타-glucuronidase가 존재한다. 실험결과를 보면 바실러스는 2,4,11,16의 활성을 갖는다. 따라서 Alkaline phosphatase, Esterase lipase, 알파-glucosidase의 활성을 갖는다.① 고체배지에서 순수 균주를 얻는 방법표면도말법(Spreading) : Spreader라고 하는 멸균된 도말봉으로 배지 전체에 희석된 시료액을 흡수할 수 있도록하게끔 펼쳐 도말하는 것. 단일 콜로니 생성.도말평판반드시 작성하여야 한다. 보통 480nm, 540nm, 600nm파장을 사용.MPN method : 미생물의 활성에 따른 반응을 보고 균 수를 측정하는 방법이다. 배지를 넣은 다수의 시험관 내에 몇 단계의 토양현탁액의 일정량을 넣고(배지에 접종하고) 배양시킨 후 세균의 생육을 여러 가지 방법에 의해 판정하여 통계처리에 의해 계수하는 방법.⑥ reagent의 역할NIT 1 reagent : 시료의 성분은 sulfanilic acid이다. NO3(nitrate)와 만나면 nitrite-sulfanic complex를 만든다.(환원)NIT 2 reagent : 시료의 성분은 N,N-Dimethyl-1-naphthylamine이다. 이 성분은 nitrate reductase test로 쓰인다. nitrite-sulfanic complex와 반응하여 붉은색을 보임.OX reagent : 미생물이 시트크롬c oxidases를 만드는지 확인할 때 사용한다. 성분은 TMPD 혹은 DMPD이며 산화시 어두운 색, 환원 시 색이 없다.JAMES reagent : 기질인 트립토판에는 인돌이 포함되어 있는데, 인돌은 다른 반응을 해석하는데 방해한다. 따라서 james를 이용하여 인돌의 여부를 판단한다.ZYM A : 성분 Tris-hydroxymethyl-aminomethane는 생리적 PH에서 완충작용의 역할. 성분 Sodium lauryl sulfate는 계면활성제로 세포벽의 인지질을 녹여 미생물 내의 효소가 나오게끔 유도한다. 즉 ZYM A는 시료의 활성을 증가시켜 ZYM B의 용해를 돕는다.ZYM B : 성분 Fast Blue BB는 alkaline phosphatase staining의 염료이다. 기본적인 색은 노랑색. 반응이 일어나면 보라색이나 오렌지색으로 바뀐다.Conclusion미생물의 순수분리를 위하여, 전 시간에 만들었던 LB Agar Plate를 사용했다. 제시된 3가지 균주(Escherichia coli, Bacillus subtilis, Streptococcu2.

자연과학| 2019.01.24| 9페이지| 3,000원| 조회(577)

연속희석, 순수분리streaking, API 20NE ZYM test

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생명공학실험. Protein Extraction단백질추출, Hydrogel Encapsulation, BCA assay

생명공학실험115 & 16주차보고서AbstractBCA assay를 이용해 단백질을 정량 하였다. BCA단백질은 단백질의 펩티드 결합을 이용한 정량 방법으로 세포 파쇄를 통해 나온 단백질을 정량 하였다. 세포 파쇄에는 RIPA buffer, Freeze & thaw, 피펫팅을 이용하였으며, 각각 1059.8518ug, 692.0740ug, 382.8148ug가 추출됐다. 가장 효과적인 방법은 RIPA buffer였고 피펫팅을 이용한 방법은 효과적이지 않았다. 또한 Hydrogel을 이용하여, 단백질을 가둬 시간에 따른 단백질의 방출량을 측정하였다. 첫 5분간은 195.6667ug의 방출량을 보였으며 10분, 15분, 20분 단백질의 방출량이 미미했으며, 비슷한 수준으로 방출되었다.IntroductionProtein Quantification: BCA AssayBCA assay는 Bicinchoninic acid에서 나온 말이며, Pierce방식이라고도 한다. 단백질이 구리 이온(Cu2+ -> Cu1+)을 환원시킬 수 있는 성질을 이용하여 단백질을 정량 할 수 있다. 1단계에서 단백질의 펩티드 결합이 Cu2+을 환원시켜 Cu1+를 만든다. 2단계에서 Cu1+ 와 2분자의 BCA가 복합체를 이뤄 보라색을 보인다. 즉 단백질에 의해 환원된 구리 이온은 BCA용액과 반응을 해서 보라 빛의 화합물을 생성하는 원리를 이용한다. 이 화합물은 빛의 특정 영역(562nm)에서 구리 이온이 담긴 용액과 BCA용액 각각보다 빛의 흡수율이 높기에, spectrophotometer를 사용해서 측정하면 흡수율 차이를 측정할 수 있다. 단백질의 양이 많으면 보다 많은 보랏빛 화합물이 생성되고 그 화합물은 빛을 더 많이 흡수한다 즉 흡수율이 증가할수록 Sample에 있는 단백질 양이 증가한다. 하지만 단백질 농도에 따른 흡수율에 대한 데이터(표준곡선)가 있어야 그 결과가 의미를 가진다. 장점으로는 단일 시약을 사용하기 때문에 방법이 간단하고 최종시료의 안정성이 높아 넓은 범위의 온도에서 가되며 EDTA가 대표적인 예이다. 다른 방법으로는 freeze-thaw가 있다. 물리적인 힘을 이용하여 cell을 파쇄 해주는 방법이다. 물이 crystal 되는 것을 이용하여 cell을 파쇄 하는 방법이며, 특정한 reagent가 필요 없이 값이 싸고 쉽게 할 수 있는 장점을 갖는다. 하지만 여러 단계가 필요하고 reproducibility가 떨어지는 단점을 갖는다.다른 물리적 방법으로는 세포를 강제적으로 좁은 공간에 밀어 넣는 Homogenizaion, 고주파 음파를 사용하는 Sonication, 막자사발을 이용한 manual grinding 등이 있다.hydrogel encapsulationHydrophilic한 성질을 갖는 3차원의 가교를 형성하는 망상 구조의 polymer로 90%이상의 물을 함유할 수 있는 natural 혹은 synthetic 물질이다. 물을 많이 함유 할 수 있는 성질 때문에 natural tissue 와 유사한 flexibility 를 갖고 있어, 의학적 용도 뿐만 아니라 다양한 산업 분야에 적용 가능하다. 주로 갈조류의 세포벽에 분포하는 anionic polysaccharide를 종종 사용한다. L-Guluronic acid (G)와 Dmannuronic acid (M)로 이루어진 2개의 unit으로 된 copolymer로서 2가 양이온 Ca2+두 개의 G block 사이에서 ionic interaction을 일으키면서 안정된 모양의 hydrogel을 형성한다. Hydrogel은 여러 가지 화학적 조성과 물성을 갖으며, 가공이 용이하고 응용에 따라 다양한 형태로 변형이 가능하다. 또한 높은 생체적합성과 주변 조직에 특정 약물 농도를 장시간에 걸쳐 지속적으로 유지시켜 줄 수 있어서 의학, 제약에 널리 사용된다. 단점으로는 낮은 인장강도와 조기 용해 과정으로 인한 빠른 소실, 소수성 약물의 탑재의 어려움이 있다.특히 생분해성 하이드로겔은 약물을 체내에서 방출한 후 가수분해나 효소분해에 의해 사라지기 때문에 외과적인 수술이나 다른 고 상층액을 취해서 다음주 실험을 위해 -80 °C에서 얼려 둔다.② Method (B): Protein extraction by Freeze & thawCell line & Others: AsPC-1, Human Dermal Fibroblast, 15ml tube, 6 well plate, Pipette, Microscope, Centrifuge, Liquid nitrogen, Ep tubeProtein extraction reagent: PBS buffer, Trypsin/EDTAPBS 1 mL을 각 well에 넣고 고르게 분포하게끔 한 후 다시 PBS를 제거한다. (Washing, 남아있는 죽은 세포 제거) 각 well에 500 uL의 trypsin를 넣고 37 °C 10 min간 incubation 하고 1ml 배지를 이용하여 trypsin을 중화 시켜 2 ml EP tube에 cell suspension을 담은 뒤, Tube를 11,800xg 5 min간 centrifuge 한다. 상층액을 제거하고 500 µL PBS buffer을 넣은 뒤, Liquid nitrogen을 이용해 얼리고 녹이는 작업을 진행한다. 위 과정을 5번 반복한다. tube를 16,000xg 20 min 간 4 °C에서 centrifuge하고 상층액을 취해서 다음주 실험을 위해 -80 °C에서 얼려 둔다.③ Method (C): Protein extraction by PipettingCell line & Others: AsPC-1, Human Dermal Fibroblast, 15ml tube, 6 well plate, Pipette, Microscope, Centrifuge, Liquid nitrogen, Ep tubeProtein extraction reagent: PBS buffer, Trypsin/EDTAPBS 1 mL을 각 well에 넣고 고르게 분포하게끔 한 후 다시 PBS를 제거한다. (Washing, 남아있는 죽은 세포 제거) 각 well에 500 uL의 tryps히 떨어뜨린다 (Bead 형태의 gel 생성 확인). Spatula를 이용하여 15개 정도의 alginate bead hydrogel을 12 well plate well로 옮겨준다 (Triplicate experiments를 위해 3 well 준비) Bead hydrogel이 들어있는 각 well에 500 µL의 물을 넣는다. Shaker table 위에 well plate를 올려둔 후 5분 간격으로 30분에 걸쳐 (총 6회 sampling) 500 µL의 물을 갈아준다. 이때 sampling 한 500 µL supernatant는 시간대별 각각 새로운 tube로 옮겨 담고 샘플링 시간을 기록해 둔다. 모든 샘플링이 끝난 후, BCA assay 를 이용하여 시간대별로 흘러나온 BSA protein의 양을 계산한다.⑤ Method: BCA assay protocolBCA assay : BCA reagent A: bicinchoninic acid (BCA) solution, BCA reagent B: 4% (w/v) cupric solution (CuSO4·5H2O), Bovine serum albumin (BSA) standard, D.W.Others : 96 well plate, Well plate reader, Pipette, Incubator, 15 mL tube실험 조교가 미리 만들어 놓은 1,000 µg/mL of BSA solution을 이용하여 (최대 농도) dilution 과정을 통해 500, 250, 125, and 0 µg/mL BSA standard solutions을 각 농도 별 250 µL씩 만든다. Reagent A (BCA solution; 3,000 µL)와 reagent B (4% (w/v) CuSO4· 5H2O; 60 µL) (*a ratio of 50:1) 를 15 mL falcon tube에 섞어준다. 25 µL의 BSA standard sample과 unknown sample을 96 well plate의 각 well에 로딩 관찰 할 수 있었다. OD562를 측정해 Fig.3.의 표준곡선을 얻었다.Y=0.0009x + 0.0068, R2이 0.9981를 보아, 신뢰 가능하고 사용가능한 수치이다. 앞으로, 측정된 흡광도(y값)을 이용해 BSA의 농도(x값)를 구할 것이다. 두번째 실험은 3개의 각기 다른 세포 파쇄법을 이용해 Protein extraction from animal cell을 시행하였다. (A) 방법은 RIPA buffer를 이용한 단백질 추출법으로 SDS를 이용하여 세포막을 파쇄 하였다. 표준곡선을 이용해 단백질의 양을 정량 하였으며 1059.8518ug이 나왔다. (B)를 이용한 방법은 Freeze & thaw 방법으로 가장 많이 사용되는 방법 중 하나이다. 표준곡선을 이용해 단백질의 양이 692.0740ug이 나왔다. (C)방법은 단순 피펫을 이용해 세포벽을 부쉈다. 단백질은 382.8148ug의 값이 나왔다. 위의 결과를 아노바와 T 테스트를 통해 통계분석 처리를 하였다. Fig. 4. 의 Anova test의 결과를 보면 Fstat > Fcritical 와 alpha > p value으로 보아, 평균값들 사이에 통계적인 차이가 있으며, 오른쪽의 T test의 결과 A, B사이에는 평균값의 큰 차이가 없다. 하지만 A,B > C 간에는 큰 차이를 보였다. 이는 RIPA buffer와 Freeze & thaw방법은 세포막을 파쇄 하는데 효과적이지만, 피펫팅은 효과적이지 않음을 의미한다. 세번째 실험에서는 Hydrogel을 이용하여, 단백질을 가둔다. 시간이 지날수록 방출량을 측정하는 실험이다. OD562과 위의 실험에서 구한 표준곡선을 사용하였다. 첫 5분에는 OD562이 0.324를 보였으며 이는 단백질 195.6667ug를 의미한다. 본 실험은 5분마다 단백질의 방출량을 측정하였는데, 첫 5분을 제외하고 10분, 15분, 20분 등 각 시간마다 단백질의 방출량이 미미했으며, 비슷한 수준으로 방출되었다. 5분마다 OD562가 대략 0.102정도로 나왔고 단백질456

자연과학| 2019.01.24| 8페이지| 3,000원| 조회(397)

생명공학실험, BCA Assay, Protein Extraction 미, Hy..

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생명공학실험. Animal Cell culture(동물세포배양) counting plating passaging(헤마토사이토미터)

생명공학실험113주차보고서AbstractAnimal cell culture와 Hemocytometer(직접계수법)를 진행하였다. 배양 전 AsPC-1 관찰결과 중간중간 모여 있으며 모양은 구형을 보였다. Hemocytometer에 로딩 하여 세포 수를 측정한 결과 23.4 x 104 cell이었다. 2일 배양 후 세포수가 늘어났음을 관찰했다. 배양 전 fibroblast는 길쭉한 모양을 보였으며, 트립신 처리 후 원형 모양을 보였다. Hemocytometer에 로딩 하여 세포 수를 측정한 결과 23.4 x 104 cell이었다. fibroblast또한 2일 배양 후 세포수가 늘어났음을 관찰했다.IntroductionAnimal cell culture동물 세포 배양이란 다세포 생물에서 분리한 세포를 특수한 용기 내에서 성장 및 보존, 세포의 세대를 보전하는 것을 뜻한다. 특수한 용기, 온도, 습도, 영양소 등의 배양 조건이 필요하다. 계대 배양은 세포증식을 위해 새로운 배양접시에 옮겨 세포의 대를 계속 이어서 배양하는 방법으로, 제한된 배양접시 내에서 세포가 증식을 멈추게 되므로 이것을 막고 세포가 증식할 수 있게끔 새로운 공간을 제공한다.1) Cell culture media: 세포에 생장을 돕기 위해 만들어진 liquid나 gel 형태의 물질을 말한다. 미생물 배지와 마찬가지로 cell type에 따른 다양한 배지가 존재하며 glucose, water, salts, amino acid 및 vitamin이 포함되어 있다. pH indicator로 phenol red가 첨가되어 있다.2) Fetal bovine serum: 동물세포 배양에 가장 널리 사용되는 혈청 보충제로 bovine serum albumin이 FBS의 주성분이다. 그 이외에 다양한 growth factor, 세포의 부착을 돕는 물질들이 함유되어 있다3) Trypsin: 이자액에서 분비되는 단백질 분해효소로 이자에서 비활성의 전구물질인 트립시노겐이 만들어지고 소장에 운반되면 엔테로펩티데이스 또는 결과로 얻어진 배지로 현재 널리 사용되는 MEM과 DMEM이 기본조성.DMEM(Dulbecco's ModifiedEagle's Media)BME의 변형된 형태 중 하나로 가장 널리 사용. BME에 비해서아미노산이 4배 정도 많고 ferric nitrate가 더 첨가되어 있음.F-12 Nutrient Mixtures(Ham's F12)CHO(Chinese hamster ovary)세포 클론 증식용으로 1960년대에 Ham, R.G.가 개발. 다양한 세포의 초대배양에 적용하는 무혈청 배지로 사용.IMDM(Iscove's ModifiedDulbecco's Media)DMEM의 변형된 형태. lymphocyte와 hybridoma 세포 배양에 많이 사용M 199(Media 199)EBSS(Earle's balanced salt solution)과 다량의 아미노산, 비타민, 성장인자, 지질복합체가 포함되어 있음. 혈청을 첨가하여 다양한세포주의 배양에 사용.McCoy's 5A Media기본 조성은 BME와 유사하나 아미노산과 비타민이 M 199 수준으로첨가되어 있음MCDB Medialow protein 또는 무혈청 배양을 위해 개발된 배지. 각 MCDB배지는특정 세포에 맞도록 개발되어 있음.MEM(Minimum EssentialMedia Eagle)BME에 비해서 아미노산의 농도가 더 높고 CO2/NaHCO3의 완충 작용을 위해 Earle's salts를 포함하고 있음. 세포 종류에 따라서 비필수아미노산이 더 첨가된 배지와 Earle's salts 대신 Hank's salts가 포함된 배지를 사용하기도 함.RPMI 1640부유 배양이 필요한 혈구세포를 in vitro에서 장기간 배양하기 위해서 개발. Rosewell Park Menorial Institute에서 개발되어 RPMI라고 명명. 부유하는 세포를 배양하는데 널리 사용.Table.1. 세포 배양에 이용되는 배지의 종류아미노산들은 세포의 단백질 합성 원료로 이용되며 L형과 D형으로 나뉘는데 그중 동물 세포에서는 ls에서 유래된다. mesenchymal stem cells은 골수와 제대혈에서 채취하는 줄기세포의 하나로 체내에 대략 100만개가 존재하는 것으로 알려져 있다. 섬유모세포의 모양을 띄고 있으며 실험관에서는 무한정 증식이 가능하며 혈액줄기세포와 달리 지방, 골세포, 연골세포와 같은 중요한 세포계열로 분화할 수 있다.섬유성 결합조직의 중요한 성분을 이루는 세포로 조직 절편으로 관찰하면 편평하고 길쭉한 외형을 가지며 흔히 불규칙한 돌기를 보인다. 세포질은 미토콘드리아· 골지체 · 중심체 등을 포함하고 그 밖에 특수한 분화는 나타내지 않는다. 핵은 염색성이 약하고 타원형이며 인을 함유한다. 교원섬유에 밀접해 있는 경우가 많고, 그 형성에 관계가 있다고 생각되므로 이런 이름이 붙었다. 동물 조직을 위한 세포외기질과 콜라겐을 합성하는 세포의 일종으로, 상처 치유에 중요한 역할을 한다. 섬유아세포는 동물의 결합 조직에서 가장 흔한 세포에 속한다AsPC-1 cell복강 내 이자의 암세포이다. 처음에는 62세 여성인 Caucasian에게 추출됐으며, 아직까지 사용 중이다. 세포는 동물에서 떼어 내어 여러 번 배양할 수 있다. 이러한 배양을 계대배양이라 하는데, 대부분의 세포들은 이러한 계대배양을 계속할 경우 어느정도 배양하다 보면 더 이상 증식하지 않고 세포들이 죽게 된다. 즉, 대부분의 세포는 무한정 계대배양할 수 있는 것이 아니다. 이를 세포의 노화라고 부른다. 그러나 암세포는 세포주기를 조절하는 사이클린-c아의 조절이 손상되어 있다. 그 결과 세포주기 조절이 되지 않고 계속 증식하게 된다. 무한정 계대배양할 수 있는 세포 line으로 사용가능 하고 시험관에서도 배양이 가능해 상업적으로 판매되기도 한다.Hemocytometer(직접계수법)Hemocytometer에 cover glass를 덮고 cell을 10ul취하여 v 모양 홈에 loading하면 모세관현상에 의해 골고루 퍼진다.현미경으로 관찰하면서 cell counter를 이용해 cell을 계수한다Hemocytomet환경을 변화시켜줄 수 있는 것이다. 만약 세포의 생존율이 낮음을 알지 못한 채 실험을 했을 경우 산출된 결과가 본래 세포에 의해 나온 결과인지 아니면 죽은 세포에 의해 나타나는 부작용에 의한 결과인지 알 수 없기 때문에 cell counting을 통한 생존율 확인, 세포의 구성요소, 세포활성, 세포분열 등은 실험결과의 신뢰도 측면에서 매우 중요하다고 할 수 있다.Materials & Methods① Animal cell cultureCell line & Others: AsPC-1, Human Dermal Fibroblast, Hemocytometer, Biosafety cabinet, 15ml tube, 6 well plate, Pipette, Microscope, CentrifugeAnimal Cell Culture: Cell culture media (DMEM), Fetal bovine serum, Trypsin/EDTA, PBS buffer배양된 cell을 현미경을 이용하여 관찰해 -배양 정도를 확인하고 기존에 있던 media를 파스퇴르 파이펫(유리)을 suction tube에 꽂아서 흡입하여 제거한다. PBS buffer 2 mL로 washing을 해주고 넣은 PBS을 제거해준다. Trypsin 1 mL 처리한 뒤, 37℃ 5min incubation을 진행하고 “DMEM+10% FBS” 2 mL을 넣고 homogeneous cell suspension을 제작한다. 이 때 100 µL는 counting 용으로 따로 확보하여 cell count를 진행한다. 11,800 x g, 5 min간 Centrifuge을 진행해 상층액을 제거해 준 뒤, DMEM+10% FBS 6 mL을 넣고 pipet을 이용하여 homogeneous cell suspension을 제작한다. 새로운 Petri dish 3개에 각 2mL씩 passage를 진행하고 37 ℃ cell culture incubator 로 옮겨 배양을 진행 한다.② Animal cell count전 단계에서lture의 경우에는 매번 실험을 할 때마다 조직에서 세포를 분리해야 한다. 그런데 동물세포 중에는 암세포와 같이 끝임 없이 분열하는 능력을 지니거나 특이적인 기능을 발현하도록 개발된 세포들이 있다. 이런 세포들을 '세포주' 라고 부른다.동물세포배양의 목적은 생명현상의 해명을 위하여 세포, 조직을 독립된 생명체로 인식하고 이들을 분자생물학 등의 연구재료로 이용하는 것이다. 현재 동물세포배양은 특정 단백질의 기능을 밝히기 위한 in vivo 상에서의 연구와 새로운 생리활성물질의 발견, 생리활성물질의 생산 기술, 배양시스템의 개발, 천연 생리활성물질로부터 유도체의 제작, 치료용 세포의 생산 등에 이용되고 있으며 그 기술이 점점 더 발전하고 있다.Fig.2.를 보면 췌장암세포인 AsPC-1는 중간중간 모여 있으며 모양은 구형이다. 본 실험에서 트립신을 처리 후 정적인 상태가 아닌 부유하는 모습을 보였다. 마치 강 위에 무언가 떠있는 듯한모습을 보였다. 2일 후 배양된 사진을 보면 수가 훨씬 늘어난 것을 확인할 수 있다. 또한 Fig.3. 을 보면 cell count도 진행하였는데, Hemocytometer는 하나의 corner squares에서 cell 수가 x 104/ml이 되도록 고안 되어 있다. 총 10칸에는 세포수가 26cell이 존재하였고 단위부피당 세포수를 계산해보면 26/10 x 1(DF) x 104 Cell/ml이다. 본 실험에서는 9ml을 사용했으므로, 23.4 x 104 cell이다.Fig.4.를 보면 Fibroblast는 길쭉한 모양으로 퍼져 있다. 트립신을 처리 후 길쭉한 모양의 세포 구조물이 떨어져 원형의 모양을 보였다. 또한 세포 외 기질과 분리돼 부유하는 모습을 보였다. 2일 후 배양된 사진을 보면 수가 훨씬 늘어난 것을 확인할 수 있다. 또한 Fig.5.를 보면 cell count도 진행하였는데, Hemocytometer는 하나의 corner squares에서 cell 수가 x 104/ml이 되도록 고안 되어 있다. 총 10칸에는 세포수56

자연과학| 2019.01.24| 8페이지| 3,000원| 조회(697)

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