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방향적 진화를 이용한 단백질 개량(Directed Evolution of Gene)

분자유전학실험방향적 진화를 이용한 단백질 개량1. 실험목적beta-glucosidase는 리포터 유전자로서 X-gal을 함유하는 배지에 이 유전자가 형질전환된 대장균을 키우면 colony가 파랑색을 띤다. 54KDa의 wild type은 protein의size가 커서 host cell에 stress를 주기 때문에 약 36amino acids를 serial deletion하여 활성부위만 갖는 유전자를 얻었지만 효소활성이 크게 줄었다. 따라서 본 실험에서는 이 축소된 리포터 유전자의 활성을 살리기 위하여 directed evolution을 통해 activity가 높아진 mutant를 찾고자 한다.2. 실험원리(1) Directed evolutionDirected evolution은 origin이 인위적으로 바뀌어도 안정화된 결과를 얻을 수 있고, 높은 효율성, 효소의 구조나 촉매 매커니즘을 알지 못해도 개량할 수 있다는 장점이 있어 현제 산업에서 널리 쓰이고 있는 전략이다. 그러나 변화된 기능에 대한 매커니즘 해석이 어렵고 안전성에 대한 검사를 추가로 해주어야 한다.directed evolution에서 mutant library는 Error prone PCR을 이용하였고 StEP PCR과shuffling으로 mutation들이 섞이도록 하여 궁극적으로 유용한 mutation product를 screening하는 과정을 거쳤다.(2) Error prone PCR(epPCR)PCR material의 조성을 바꾸면 Taq polymerase의 fidelity를 낮아지는 성질을 이용한 방법이다. 주로 MgCl2의 농도 증가, MnCl2 첨가, .불균형의 뉴클레오티드 농도, Taq polymerase 농도 증가, nucleoside 유사물질 첨가등 PCR 수행조건을 다르게 해준다. 우리는 solvent인 1-propanol을 PCR반응에 첨가하였다. 단백질의 3차 구조를 형성하는데는 여러 약한 힘과 함께 소수성결합이 매우 중요하다. 1-propanol(C-C-C-C-OH)로 template switching하여 각 생성물은 잠깐씩 만났던 돌연변이들을 다 갖고 있게 된다.그러나 primer의 size가 커질 수록 dsDNA는 2차 구조를 형성할 가능성이 높아져서 anealing과 denaturation이 완전하게 되기 어려울 뿐만 아니라 polymerase의 접근도 제한하는 문제가 있다. 그러면 전기영동에서도 본래 크기보다 작게 나온다. 이러한 megaprimer가 되지 않도록 cycle수를 줄이고 template는 1kbp를 넘지 않는 것이 적당하다.(4) DNA ShufflingDNA 유전자 조각들을 무작위로 순서없이 섞어서 매우 다양한 mutant library를 구축할 수있는 방법이다. homologous 유전자를 template로 사용하거나 하나의 template로부터 유래한 다양한 유전자를 template로 사용하므로 매우 다양한 변이 유전자를 생성시킬 수 있다. StEP PCR과 비슷하지만 endonuclease를 사용하는 점이 다르다.효소는 주로 RNaseⅠ과 4 cut REase를 쓰고 양이온으로 무엇을 쓰느냐에 따라 효소의 활성이 달라진다. Mn, Mg, Ca, Zn이온을 첨가하면 DNA에 DNaseⅠ이 잘 결합할 수 있게 하며 특히 Mn을 쓰면 1번 자른 DNA는 효소가 다시 자르지 않도록 한다고 알려졌다. 나머지 이온은 random하게 계속 자른다.template로 쓴 glucosidase gene에는 Sau3AⅠsite가 많아서 partial digestion하였다.절단 서열 GATC가 1/44빈도록 출현 하면 약 10군데를 자른다. fragment가 GATC end를 갖지만 Tm값 보다 높은 온도에서 ligation하여 fragment내의 더 긴 상보적인 서열끼리 결합하도록 할 것이다. 그래서 무엇으로 절단 하든 결과는 같다. DNase는 0.001㎕만으로도 상온에서 모두 분해해서 다루기 까다롭다.다음으로 PCR을 하는데 이때 primer를 따로 넣주지 않고 fragment가 서로 primer가 되어 합.2617-> 300㎕ 1.09㎎->0.1613-> 200㎕※ chaotropic agent : 약산의 화학물이 비공유결합을 절단한다. bisacrylamid를 분산 하여 gel을 녹이는 목적으로 사용하지만 dsDNA를 ssDNA로 변성하기 때문에 반응 시간을 짧게하고 낮은 온도에서 작용하도록 tube를 손에 감싸서 녹인다.② solution을 column에 옮기고 salt 제거를 위해 60㎕ ethanol washing한다.※ resin은 전하를 띠는 물질을 거르기 때문에 인산기와 당의 수산기를 갖는 DNA뿐만 전기 영동을 해도 걸러지지 않은 소량의 taq pol.과 dNTP, primer, salt또한 전하를 띠어 불순물이 된다. salt는 resin과의 결합력이 약하기 때문에 centrifuge X2로 불 순물을 제거 한다.③ DDW를 10㎕를 넣고 entrifuge 2min. 하여 1-propanol을 제거하여 나중에 RE처리에 영향을 미치지 않게 한다.④ DDW로 elution product를 회수하고 2㎕만 따서 전기영동으로 band를 확인한다.(3) StEP PCR protocol : metirials은 보통으로 하고 PCR programing에서① PCR metirialstemplate0.5primer0.25dNTP2buffer0.25DDW16.8taq polymerase0.15total20 (㎕)② programing 때 anealing time을 5sec.로 줄이고 cycle을 denaturation과 anealing사 이만 돌도록 맞춘다.(보통은 30sec.)※ cycle 돌때마다 denaturation의 시간이 1초씩 증가하게 설정한 이유 : StEP은 짧은 denaturation과 annealing시간을 줘서, primer가 template를 바꿔가며 mutation이 섞인 DNA가 합성된다. cycle이 지날수록 ssDNA길이가 점점 길어지게 되고, 그 결 과 완전히 denaturation하는데 시간이 더 필요하게 된다. 예를 들면 DDW116taq polymerase0.150.15total20(㎕)20(㎕)⑦ elution한 DNA fragment를 template및 primer로 5cycle PCR을 한다.12PCRproducts57primer55dNTP55buffer33DDW2taq polymerasetotal25(㎕)25(㎕)⑧ PCR products를 다시 35cycle의 normal PCR을 한다.※ primer는 이번 PCRproducts를 coloning하기 위해 REaseⅡ site를 포함하고 있다.NcoⅠ는 start codon을 포함하는 인식부위를 가지고 있어서 readingframe이 GGTACC 망가지지 않게 insertion시키는 손쉬운 방법이 된다. G*자리부터 start codon.※ 35cycle의 normal PCR해주는 이유 : 증폭하여 양을 늘리고 전기영동으로 목적size를 selection 가능 하기 때문이다. 또 처음 PCRproducts 각 증폭된 양이 모두 같지 않 을 것이므로 2n배의 n의 수가 증가할 수록 처음 PCR후의 양차이보다 더 커지므로 cycle을 적게 한다.⑨ DNA elution 과정 REaseⅡ 처리 후 다시 DNA elution(5) transformation① NcoⅠ처리한 vector를 insert와 1:1로 섞어 37℃에서 1~2hr. ligation한다.② CPcell solution을 construct가 든 tube에 넣고 30min. ice에서 정치한다.③ heat shock을 주고 cell을 안정화 시킨다.④ 100㎕를 따서 5개 X-gal과 Amp이 포함된 plate에 spreeding한다.⑤ incubation 1~3일째에 colony를 보고 파랑색을 띠는지 확인한다.5. 결과 및 고찰(1) error-prone PCR 결과 및 고찰▲ 1-propanol의 비율을 달리해준 sample ▲ MnCl2의 mM을 달리해준 sample(원본을 잘라 순서대로 나열해 놓음)․ control인 DDW과 비교해 볼 때 실험군은 여 30cycle이상을 돌면 error rate가 올라가는등 수명을 다한다. 그럼 epPCR때 30cycle 을 돌렸지만 polymerase의 활성은 15cycle정도 돌다가 잃어버렸다면 실제 증폭된 것은 15cycle정도만 되어 예상한 것보다 증폭이 덜 되어 band가 전체적으로 희미하게 나올 수 있다.(2) StEP 결과 및 고찰template 길이가 1.5kb정도 되는데 길이가 비슷한 seiz에서도 수렴하는 형태가 되지 않 고 전체적으로 끌려서 나왔다. 정상 PCR을 해도 이러한 퍼진 형태는 실패로 본다. ▶(3) shuffling 후 transformation 결과 및 고찰ampicillin이 든 배지에 colony는 떴지만 β-glucosidase의 활성이 없었다.우선 배지에 colony가 떴기 때문에 ampicillin 저항성을 가지고 있다고 생각된다. 이러면 vector는 세포 안으로 들어갔다고 생각할 수 있다. 생각되는 가능성은 세 가지다. 하나는 error-prone PCR와 shuffling을 한 insert DNA를 vector에 넣어서 transformation을 했는데 그 insert DNA인 β-glucosidase의 활성이 높지 않지 않았다는 것이다. error-prone PCR의 경우 point mutation이 일어나는데 염기 하나가 바뀌었다고 해서 아미노산이 바뀐다는 보장도 없고 바뀐다고 해도 전에 있던 아미노산과 성질이 비슷하면 구조적 변화는 일어나지 않는다. 또, point mutation이 일어나서 염기가 바뀌었다고 해도 active site가 아닌 구조변화에 관련 없는 부위에 된다면 구조변화는 조금 있을지 모르지만 활성변화에는 크게 영향을 미치지 않는다.두 번째 가능성은 self-ligation이다. vector에 insert DNA가 들어가야 하는데 들어가기 전에 self-ligation이 된 후에 transformation을 하게 되면 vector에 있는 ampicillin 저항성을 획득하게 되지만 insert DN.

자연과학| 2017.09.09| 8페이지| 1,000원| 조회(228)

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